采用高分辨率光纤氧微电极测定了富营养化水体中沉水植物菹草(Potamogetoncrispus)茎叶微界面(0—2.0mm)氧(O2)。菹草叶微界面O2浓度梯度具明显的时空变化。时间上，菹草叶微界面O2浓度具有明显的生长阶段变化和昼夜变化。幼苗期和快速生长期微界面O2浓度增加幅度较小，稳定期叶表O2浓度梯度增加幅度最大，衰亡期叶微界面O2浓度受附着物影响具明显的空间梯度。菹草叶微界面O2表现为昼高夜低的单峰变化模式，主要受光照和温度的影响。空间上，越接近茎叶表面，O2浓度越高。顶部幼叶微界面O2浓度梯度增加较平缓，中部成熟叶微界面O2浓度梯度变化最陡，波动幅度最大，中部茎和基部衰老叶微界面O2浓度梯度由于受密集附着物的影响，在附着物表面达到最大值，进入附着层后略有下降。结果表明，菹草茎叶微界面O2时空变化主要受附着物和植物光合放氧能力的影响。光纤微电极是一种分析植物叶微界面氧时空分布的理想工具，对深入研究植物微界面在富营养化水体中养分的迁移转化具有重要意义，可为水生植物生理生态研究提供有力工具。


Reddy发现湿地植物根系附近存在富氧-厌氧微环境，提出并用同位素技术证实了根-沉积物界面的硝化-反硝化理论，并结合微电极取得一系列重要的成果。理论上，沉水植物的茎叶与水之间亦存在类似于根-土壤/沉积物的微环境(界面)。位于水面以下的沉水植物茎叶表面常有各种藻类、微生物、菌胶团、泥沙和碎屑等物质附着，形成了特殊的生物-水微界面。


沉水植物光合作用产生的氧气通过茎叶表面散逸到水中，在茎叶表面形成富氧区，而附着层内富集的有机质分解耗氧容易导致茎叶表面成为缺氧微区，这可能将对微界面内物质的迁移转化有重要影响。研究表明淡水沉水植物菹草(Potamogetoncrispus)和海洋植物褐藻(Fucusvesiculosus)叶微界面(0—2.0mm)内O2浓度空间分布差异比较明显，但仅有的上述研究均集中在光对特定生长阶段水生植物叶微界面O2分布的影响上。不同生长阶段、不同部位沉水植物微界面O2分布有何差异？附着物对沉水植物微界面O2分布有何影响？对此人们还了解甚少。


鉴此，本研究利用光纤氧微电极技术，分别从时间(昼夜、季节)和空间(不同部位)尺度上研究了菹草茎叶微界面O2的分布，揭示了造成其时空差异的可能机理，对深入研究富营养化水体中植物衰退机制和养分循环具有重要意义。


1、材料与方法


1.1试验材料

菹草采自南京市富营养化水体(总氮TN) = (1.05±0.07) mg/L,总磷(TP) = (0.11±0.02) mg/L,NH+4-N = (0.12±0.03) mg/L,叶绿素a = (18.15±3.41) mg/L,透明度= (0.40±0.08) m,化学需氧量(CODMn) = (7.95±0.27) mg/L) 三用河(32°06’N,118°55’E)，自2013年3月上旬至6月上旬，分别在菹草幼苗期、快速生长期、稳定期和衰亡期采集整株植物5—7 株，置于装有冰袋的保温箱中，同时采集原位水5000 mL，为避免菹草附着物在运输过程中脱落，植物和水分别装在不同的容器中。2 h内运回实验室，植物茎叶微界面O2 置于原位水中稳定3 d后测定，水质指标12 h内测定。同时利用水下调制荧光仪DIVING-PAM (Walz GmbH,Effeltrich,德国)现场原位无损伤测定菹草的叶绿素荧光参数。在菹草稳定期，另采集整株成熟菹草3—5株(株高(120.0±5.1) cm，叶片数52±5)用于测定不同部位(图 1a)微界面O2，幼叶(位于顶端附近且完全展开的叶)、成熟叶(茎中部(叶长(5.0±0.3) cm，叶宽(0.5±0.02) cm)，叶面积达到最大但无衰老迹象)、衰老叶(茎基部附近，明显发黄)、茎(中部，成熟叶着生附近)。


1.2菹草茎叶微界面O2的测定


将整株菹草置于装有原位水的方形玻璃缸中，使整株植物悬浮在水中，茎和叶片用订书针固定在琼脂板上(4%)(图1b)。通过控温台使水温保持在(20±0.5)℃。在卤素光纤灯(150W)控制光密度100μmol photons/m2s下进行测定。采用针式光纤氧微电极(丹麦Unisense)进行测定。电极尖端直径<50μm，快速响应时间小于3s，在线温度补偿，检测范围为0—250%饱和空气(0—22.6mg/L)，检测下限为0.2%饱和空气。使用前用饱和湿空气(100%O2)和饱和Na2SO3溶液(0%O2)进行两点校准。将电极固定在三维自动操纵器上，控制电极以设定的步进接近茎叶表面。借助解剖显微镜跟踪电极的移动，用来确定菹草附着物的表面，可结合显微镜与电极信号变化来判断叶表面。数据通过软件Microx TX3获取。每个茎叶测定3个不同点，由于电极稳定性较好，每个点测2个剖面，取3个点的平均值作图。

图1成熟菹草和测试图


1.3菹草叶面O2昼夜变化的测定


在菹草稳定期，采集完整成熟菹草3株，用原位水置于方形玻璃缸中在温室内驯化培养3d后测定(图1b)。选择晴朗天气(2013年4月26日6:00—27日早6:00)江苏省生态修复平台玻璃温室中进行，借助显微镜和电极信号，找到叶片表面，10min自动记录一次数据，连续测定24h。测定O2和温度的同时，采用ZDR—14型照度记录仪同步记录光强。2013年4月26日6:00—27日6:00，温度最高30℃，最低13℃，据国家授时中心网站(http://time.kepu.net.cn/)查询得监测时段日出、日中、日落时刻。4月26日日出时刻为05:24，日中时刻为12:03，日落时刻为18:42，4月27日日出时刻为05:23，日中时刻为12:03，日落时刻为18:42。故将26日6:00—18:42及27日05:23—6:00作为白昼。


1.4附着生物的分离与测定


从不同菹草植株上采集典型茎叶10g左右装入盛有200mL无菌水的聚乙烯瓶中，每个样品3个重复，带回实验室。用软毛刷和无菌水轻轻刷洗植物表面，用显微镜观察确保附着物完全刷下且茎叶表面未受损。刷洗液连同软毛刷冲洗液一并收集，将收集的样品定容500mL。将得到的附着物悬浊液分成四等份，两份通过预烧和预称重的Whatman GF/C滤膜(孔径0.45μm)(用于干重分析)真空抽滤，另两份通过醋酸纤维滤膜(孔径0.45μm)(用于叶绿素a分析)真空抽滤。附着物干重(DW)通过真空抽滤后将带有附着物的滤膜在105℃下烘24h测定。附着物灰分重(AW)通过抽滤物在马弗炉中550℃燃烧4h测得。附着物的无灰干重(AFDW)通过燃烧损失的质量干重与灰分重之差计算得到，也可表示附着有机物含量。附着物叶绿素a(Chl a)采用标准方法，用90%的丙酮提取，分光光度法测定。得到的结果通过植物单位干重计算。


1.5快速光响应曲线的测定


菹草快速光响应曲线(Rapid light curves，RLCs)采用水下荧光仪Diving-PAM和数据采集软件Wincontrol(Walz GmbH，Effeltrich，德国)进行原位测定，测定具体操作方法参照文献。


1.6统计分析


采用SPSS17.0进行数据统计分析。统计分析前，对所有的数据先进行正态分布和方差齐性的假设检验。用单因素方差分析(ANOVA)检验不同生长阶段附着物干重、灰分重、无灰干重和叶绿素含量的差异，如果差异显著，进一步通过Tukey HSD用单因素方差分析检验(P﹤0.01)。不同部位附着物干重、灰分重、无灰干重和叶绿素含量的差异亦采用上述方法。采用Origin Pro 8进行绘图。


光纤氧微电极揭示菹草叶微界面O2分布、浓度梯度的时空变化（一）

光纤氧微电极揭示菹草叶微界面O2分布、浓度梯度的时空变化（二）

光纤氧微电极揭示菹草叶微界面O2分布、浓度梯度的时空变化（三）