摘要在脑神经系统中，过氧化氢（H2O2）和多巴胺（DA）的同时分析具有重要的意义，但二者的同时实时分析具有很大的挑战。本研究制备了可用于二者同时电化学分析的环盘微电极，中间的碳纤维盘（CFdisk）电极通过电化学沉积选择性地修饰普鲁士蓝（PB），并电聚合聚3，4乙烯二氧噻吩（PEDOT）保护PB，检测H2O2，金环（Auring）电极检测DA。研究结果表明，此电极对H2O2的线性检测范围为1～29μmol/L，检出限为0.4μmol/L;对DA的线性检测范围为0.5～25μmol/L，检出限为0.18μmol/L，两电极之间未交叉干扰。采用此电极检测了大鼠脑内的DA和H2O2浓度的变化。本研究为有关H2O2和DA的神经生理和病理的研究提供了新的方法。


1、引言


过氧化氢（H2O2）是脑神经系统中重要的调质。一方面，H2O2是活性氧物质（ROS）之一[1，2]，浓度过高会引起大范围细胞损伤，与帕金森综合症等疾病密切相关[3，4];另一方面，越来越多的研究表明，H2O2是信号分子[1，5]，不仅是细胞生长和细胞器功能的调节者，也是神经元之间、神经元与胶质细胞间的扩散性信使分子[6]，并且在突触传导和可塑性方面也有着重要作用[7]。如神经元中多巴胺（DA）和6羟基多巴胺（6 OHDA）的氧化产生H2O2，可调节神经元生理状态[8，9]，在纹状体神经元中，谷氨酸激活α氨基3羟基5甲基4异恶唑丙酸受体（AMPAR）可在下游产生H2O2，产生的H2O2作为信号分子，通过钾离子三磷酸腺苷（K ATP）通道抑制轴突释放DA[10，11]。因此H2O2与DA的同时分析对于了解二者的相互作用具有重要意义。


活体原位电化学分析是将微电极植入特定脑区，对脑神经系统内的物质进行分析的方法[12～20]，因其为时空分辨率高，电极易于微型化、阵列化[21～27]，在脑神经科学中的应用越来越多。但是脑内物质多样，性质相近，多种物质分析必须克服相互之间的交叉干扰[28，29]，因此建立具有高选择性的多组分的原位实时电化学分析方法具有很大的挑战。本研究设计了一个可同时检测两组分的微电极，如图1所示，中间为碳纤维盘（CFdisk），外周为纳米金环（Auring），以H2O2和DA為例，在CFdisk电极上修饰普鲁士蓝选择性分析H2O2，Auring电极检测DA。本研究结果有助于更深入研究脑神经系统中H2O2和DA的生理功能和二者的相互关系。

2验部分


2.1仪器与试剂


CHI760D电化学工作站（;三电极系统：CFdiskAuring电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极;WD 2微电极拉制仪;JPC 200磁控溅射镀膜机;FE20/EL20型实验室pH计;JSM 7401F扫描电子显微镜。


K3[Fe（CN）6]、FeCl3、NaOH、浓H2SO4（98%）、乙腈（国药集团化学试剂有限公司）;3，4乙烯二氧噻吩（EDOT）、多巴胺（DA）、H2O2（Sigma公司）;pH 7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS）由50 mmol/L的KH2PO4 K2HPO4组成;人工脑脊液（aCSF，pH=7.4）由KH2PO4（0.5 mmol/L）、NaHCO3（27.5 mmol/L）、NaCl（126 mmol/L）、KCl（2.4 mmol/L）、CaCl2（1.1 mmol/L）、MgCl2（2.4 mmol/L）和Na2SO4（0.5 mmol/L）组成;所用试剂均为分析纯，实验用水均为去离子水，室温（25℃）下操作。


2.2实验方法


2.2.1微电极的制备

微电极的制备如图1所示，使用微电极拉制仪在820℃的拉制温度下将玻璃管（i.d.1.5 mm，L=10 cm）拉制成两个尖端很细的毛细管，拉制完成后，用玻璃刀割开毛细管尖端，控制端口直径为20～30μm。将碳纤维用导电银胶连接到铜丝上，小心穿入到上述制备好的毛细管中。用502胶将毛细管两端封住，放置过夜，使502胶固化，制备成碳纤维电极（CFE）。再将CFE置于磁控溅射镀膜仪中，在玻璃管外壁镀金层（约350 nm），取出后用铜丝连接金层，并用蜡封金层绝缘，制成金环电极。将制备好的CFE Auring电极用2000目砂纸打磨，制成CFdiskAuring电极，超声，冲洗后备用。


活化CFdiskAuring电极：CFdisk电极在1 mol/L NaOH溶液中+1.5 V电位下活化80 s，然后在0～+1.0 V电位范围内，以50 mV/s的扫速循环扫描至峰电流稳定为止;Auring电极在0.05 mol/LH2SO4溶液中，以50 mV/s的扫速在0.2～+1.8 V电位范围内循环扫描至峰电流稳定为止。电极活化之后，在CFdisk电极上利用恒电流沉积法（电流密度，2μA/cm2），在含有1 mmol/L K3[Fe（CN）6]和1 mmol/L FeCl3的KCl（pH=2，0.1 mol/L）溶液中沉积800 s，获得普鲁士蓝（PB）修饰的CFdisk（PB/CFdisk）电极。将PB/CFdisk电极在含10μmol/L EDOT的乙腈和KCl混合溶液中进行循环伏安扫描2圈，电位范围是0.1～+1.2 V，扫速为50 mV/s，获得PEDOT/PB修饰的CFdisk（PEDOT/PB/CFdisk）电极。


2.2.3动物实验

实验动物为雄性Sprague Dawley纯种大鼠（350～400 g），购于北京大学医学部实验动物中心，于室温条件下在自然光照周期中自由饮水进食，所有动物实验过程均遵照国家纳米科学中心动物饲养及实验条例。大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉（345 mg/kg，i.p.），剔除老鼠头部毛发，用酒精消毒后，将大鼠头部固定在立体定位儀上，开颅，去除软脑膜。将双极刺激电极植入到内前侧脑束（MFB）（Ap=2.2 mm，L=1.6 mm，V=7.3 mm），将制备的环盘微电极植入到伏隔核（NAc）（AP=1.8 mm，L=1.5 mm，V=6.5 mm）。对双极刺激电极施加频率60 Hz，±300μA的电刺激信号3 s，刺激NAc脑区释放DA。检测H2O2时，将10 mmol/L H2O2以10μL/min流速注入到NAc区域，记录H2O2信号。