2、纳米模拟酶在活性氧检测中的应用


2.1超氧阴离子（·）的检测


Sadeghian等制备了一种三维纳米金网电化学传感器（图3）。多孔金纳米网（NPGM）上附着Cyt-c并与工作电极结合，来测量药物诱导C2C12细胞的·通过多孔膜的释放速率。该传感器对·的灵敏度为7.29 nA/（nmol/L·cm2），最低检出限为70 pmol/L。该工作通过改变纳米金的的形貌来增加比表面积，提高了该超氧化物传感器的电化学性能。这项工作将为开发高灵敏度的分子电化学生物传感器提供了一个平台。

图3细胞外超氧化物的电化学检测（a）通过氧化还原蛋白（Cyt-c）与电极之间的氧化和直接电子转移来实现的传感机制；（b）细胞被界面连接功能化电极示意图


除了上述提到的Au NPs以外，Pt NPs也可作为·的催化剂与石墨烯相结合作为类超氧化物歧化酶。2019年，Hu等通过电沉积将Pt NPs沉积在三维石墨烯泡沫（3D GF）上构建原位检测·的三维传感平台。Pt 3D GF具超强的电化学活性，能使电荷转移电阻降低85%，且3D GF是一个具有生物相容性的平台，有较高的表面积且适合细胞附着/生长。该平台有明确的表面和界面特性，可实现从细胞中释放的·的现场监测。此外，研究发现，在3D GF上沉积Pt NPs，减少了带负电荷的·和电极表面之间的排斥力，使得3D GF有更高的电子转移速率和更好的电催化活性。

图4钴纳米复合材料的制备及其对·检测流程图


相比于MOFs的不断改进，将磷酸锰与其他生物技术相结合应用于对·的电化学传感也是一个较好的方向。Wang等构建了一个基于细菌纤维素脱氧核糖核酸-磷酸锰（BC DNA-Mn3（PO4）2）的丝网印刷电极的活细胞传感界面。活细胞被固定在BC DNA-Mn3（PO4）2纳米酶传感平台上，以快速、可靠地检测活细胞释放的·。该类传感器在小型化、生物相容性、成本低和实时监测方面具有巨大的潜力。这项研究进一步表明，现有的构建活细胞传感界面的方法在未来的原位检测技术和下一代智能生物芯片、疾病诊断方面具有十分广阔的前景。


近年来，研究人员使用电化学技术将纳米模拟酶与特定的传感元件结合用于开发检测·的电化学传感器。将有机材料与无机材料相结合用于改善电化学传感器的线性范围窄、检测限不够低等缺点，并提高传感器对·的选择性、稳定性。表1展示了用于·检测的不同修饰电极的性能比较。

表1用于·检测的不同修饰电极的性能比较

2.2羟基自由基（·OH）的检测


·OH在高级氧化过程（advanced oxidation processes）中作为主要氧化剂降解持久性污染物。但同时·OH也会破坏碳水化合物、核酸、脂类和氨基酸等生物分子，并对生物体和人类造成极大危害。·OH被认为是生物系统中产生的最强大的具有潜在危险的ROS，过量可能会导致细胞损伤。·OH的浓度也与各种癌症、糖尿病和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）有关，了解·OH浓度与这些疾病之间的关系有助于更好地诊断和预防。因此，开发能够快速分析·OH的灵敏检测方法是非常重要的。


Huang等通过构建一个使用DNA和6-巯基己醇（MCH）的生物传感器，证明了DNA氧化损伤的程度与·OH的浓度有关。他们以氮掺杂的多孔碳材料和AuNPs作为信号放大器，进一步提高了电化学探针的灵敏度和最低检出限。通过电化学探针［Ru（NH3）评估·OH诱导的DNA损伤。该传感器具有良好的电导率，其检测限为25.0μmol/L。


尽管上述基于DNA的生物传感器很容易制备，但DNA存在易降解等缺点，这极大地限制了它的实际应用。抗氧化剂被认为是防止自由基损伤的还原剂，Abdel-Hamid等将咖啡酸（CAF）作为抗氧化剂，通过清除自由基来防止·OH的形成，这可以保护DNA不被降解。为了研究双链DNA（dsDNA）与咖啡酸（CAF）的相互作用并评估抗氧化性能，采用多壁碳纳米管固定dsDNA并作为玻碳电极修饰材料。在本研究中，同时研究了·OH对DNA造成的氧化损伤，并观察到在加入CAF后，由于其清除·OH的特性，ds-DNA受到保护。该项工作能够构建生物传感器用于鉴定DNA损伤，对癌症、病毒感染等疾病的预防具有非常重要的参考意义。


除了通过直接的DNA氧化损伤程度来检测·OH的浓度外，还可以通过检测其他·OH捕获物来间接检测和判断·OH的浓度。Li等将羧基功能化石墨烯（CFG）通过自组装单分子膜技术（SAMs）与乙二胺（NHCH2CH2NH）共价相互作用固定在玻璃碳电极（GCE）上，得到快速、灵敏检测·OH的CFGNHCH2CH2NH/GCE电化学传感平台。在测定过程中，·OH的浓度不是直接获得的，而是采用4-羟基苯甲酸（4-HBA）作为·OH捕获物，间接测得·OH。


Duanghathaipornsuk等提出了一种超灵敏的电化学传感器。该传感器由超小氧化铈纳米团簇（＜2 nm）电沉积在丝网印刷碳电极（SPCE）上构筑而成。该电化学传感器的检测限（LOD）为0.6μmol/L。此外，该纳米氧化铈电化学传感器在体外成功检测到新生小鼠骨组织的成骨细胞中存在·OH。为了最小化Ce NPs的尺寸，从而最大限度地增加用于·OH清除和检测的Ce3+位点的数量（式（1），（2）为氧化铈与羟基自由基反应原理），该团队采用表面有机金属化学（SOMC）合成策略来获得纳米级的CeOx，通过控制有机金属前体的负载来调整CeOx纳米团簇的大小和分散性。超灵敏电化学传感器有望应用于医疗诊断、燃料电池技术以及食品和化妆品行业。


在活性氧检测领域，对·OH的检测相对偏少，这是因为·OH具有较高的化学反应性，寿命极短（在生物系统中约为15 s），且难以在模型系统中进行检测并研究其与DNA损伤的关系。在众多研究中Ce NPs对·OH具有极高的选择性，这为·OH的检测提供了新思路。另外还可以通过直接判断DNA的损伤程度来检测·OH浓度或通过·OH捕获物间接检测·OH。表28，64，66-6展示了用于·OH检测的不同修饰电极的性能比较。

表2用于·OH检测的不同修饰电极的性能比较


2.3 H2O2的检测


H2O2是一种简单、重要且功能强大的氧化剂，广泛应用于化工、临床应用、药物分析、食品制造和环境保护等多个领域。它不仅在化学和工业过程中产生，而且是人体中多种氧化代谢途径的副产物。为了保证生物功能的正常，H2O2浓度必须低于100 nmol/L，高于此浓度会导致细胞的氧化应激和损伤从而导致严重疾病（如癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病等），甚至加速衰老。因此，实现快速、准确的检测H2O2至关重要。以下介绍几种用于检测H2O2的电化学传感器：


MOFs对H2O2的氧化表现出独特的电催化活性。Sherino等制备了一种以己二酸（adipic acid）为连接剂和哌嗪（piperazine）为载体的镍金属有机材料（APNi-MOF），并将其用作检测H2O2的电极材料（AP-Ni-MOF/CPE）。AP-Ni-MOF具有1.28×10－3S·cm－1的高电导率，对H2O2的检测具有很高的电化学活性。AP-Ni-MOF/CPE检测范围是0.004～60 nmol/L，检测限为0.0009 nmol/L。AP-Ni-MOF/CPE电极在H2O2的实际样品检测（透镜清洁剂溶液）中表现出了良好的重现性、稳定性和选择性。Liu等开发了一种新型的卟啉铁金属有机框架（pFeMOF）修饰的有序介孔碳（OMC），用于检测活细胞释放的H2O2。该pFeMOF/OMC复合材料是通过简单的一步水热法制备而成，Fe（Ⅲ）离子与卟啉基团的羧酸盐具有很强的配位作用，可以使合成的MOFs更加稳定。pFeMOF可以模拟过氧化物酶特性，获得良好稳定的电化学信号。此外，通过引入了OMC提高pFeMOF的导电率，同时OMC可以有效地控制pFeMOF晶体生长。这一策略改善了pFeMOF团聚从而使得更多的活性位暴露，提高了该复合材料的电化学活性。


在各类纳米金属与不同材料相结合的功能结合型材料中，除了金属框架的MOF外，碳基金属材料的导电性能也非常优异。Zhang等将一维金纳米粒子（AuNPs）组装在磁性氮掺杂碳纳米管（NCNTs）上，再与细胞色素c（Cyt-c）结合制备出基于Cyt-c/NCNTs Fe3O4 Au的传感器。其引入的AuNPs不仅不会破坏Cyt-c的天然结构，还能增强Cyt-c在电极表面的电催化特性。该传感器用于检测H2O2，其检测限低至0.3μmol/L。


与同为碳基材料的碳纳米管相比，石墨烯具有更大的比表面积与稳定性，Zhao等报告了一种快速制备银纳米粒子锚定激光诱导石墨烯（LIG Ag）电极的方法，并用于H2O2检测。通过偏焦激光烧灼方法，银纳米粒子可以均匀分布在具有缺陷和微孔的层状结构的LIG纳米片上，LIG可以抑制银纳米粒子的尺寸增加，同时银纳米粒子也可以防止石墨烯纳米片的团聚。Ag NPs和LIG纳米片的协同效应使LIG Ag电极在许多方面呈现出优异的电化学性能。该传感器具有良好的稳定性、重复性、选择性，对H2O2的检测限约2.8μmol/L，灵敏度为28.6μA（mmol/L·cm2）。由于LIG Ag电极具有优异的导电性、机械灵活性和轻质等特点，该方法为大规模制造智能传感设备提供了一种新思路。


H2O2检测已经在工业领域和生物研究中获得了广泛的应用。在各种H2O2检测策略中，电化学因其高精确度和可靠性、良好的灵敏度和选择性、低检测限、快速反应和小型化引起越来越多的关注。随着纳米材料的快速发展，各种纳米材料被作为纳米模拟酶应用于生物传感领域。表3为用于H2O2检测的不同修饰电极的性能比较。


表3用于H2O2检测的不同修饰电极的性能比较


3、总结与展望


纳米酶已成为广泛用于各种领域的热门材料。特别是在生物传感领域，与天然酶相比，纳米模拟酶因其独特的催化活性，在检测活性氧的生物传感器的构建及应用中发挥着重要作用。部分纳米模拟酶作为电化学活性材料对一些特定的活性氧物质具有独特的催化性能，受到研究者的广泛关注。


随着与纳米模拟酶有关的研究迅速增加，纳米模拟酶应用于ROS检测的研究也取得了一定的进展，但在实际检测过程种还存在着一些问题，具体如下：


（1）目前的研究大多集中在通过调节纳米模拟酶的尺寸、形貌和结构来优化纳米模拟酶对ROS的催化性能，对纳米模拟酶中活性位点的研究还很缺乏。


（2）对纳米模拟酶与活性氧的催化机理的研究还不够深入，因此了解其催化机制对设计新型纳米酶和调节其活性具有重要意义。


（3）纳米模拟酶在应用过程中可能会与细胞内成分如蛋白质、核酸和小生物分子等发生相互作用，而导致其正常的生理功能的破坏。因此，有必要提高纳米模拟酶的生物相容性，以开发出新型电化学生物传感器，用于原位或实时检测ROS。


本文总结了纳米模拟酶在不同种类活性氧的电化学生物传感器方面的最新进展，讨论了其在当前研究中的不足之处，为今后的研究提供参考。我们期望对新型的纳米模拟酶进行进一步的研究开发，以提高其性能，加快发展纳米模拟酶在ROS检测和分析中的应用。