研究简介:随着核技术在能源生产、医疗和工业应用中的广泛使用，人们越来越关注辐射对人体健康的影响。电离辐射对生物体的损伤主要通过两种方式产生：直接作用和间接作用。直接作用是指辐射直接与生物大分子相互作用，而间接作用则是指辐射首先与水分子作用，产生具有高反应性的自由基，如羟基自由基(.OH)，这些自由基随后与细胞内的脂质、蛋白质和DNA发生反应，导致细胞损伤。在众多的自由基中，羟基自由基(.OH)因其高反应性而被认为是辐射诱导损伤的主要介质。尽管已有一些辐射防护剂，如硫醇化合物氨磷汀(WR-2721)，但它们通常伴随着副作用，限制了在临床上的应用。因此，寻找一种安全有效的辐射防护剂成为了一个重要的研究课题。氢气(H2)因其独特的物理化学性质，如高扩散性和选择性抗氧化能力，被认为是一种潜在的辐射防护剂。氢气可以选择性地减少细胞毒性活性氧(ROS)，如.OH和过氧化亚硝酸盐(ONOO-)，而不干扰生理上重要的氧化还原反应。此外，氢气在体内外均显示出治疗性抗氧化活性，且没有已知的毒副作用。本研究旨在探讨氢气对辐照生殖细胞的保护作用及其潜在的辐射防护机制。研究者们使用了富氢盐水，通过高压将氢气溶解在生理盐水中，制备出用于实验的溶液。


通过一系列实验，包括自旋捕获技术、羟基苯基荧光素(HPF)荧光探针检测、生化检测和细胞凋亡测定等方法，研究者们评估了氢气对辐射诱导的生殖细胞损伤的保护效果。研究结果表明，氢气能够显著降低辐射过程中产生的羟基自由基水平，减少脂质过氧化、蛋白质羰基化和DNA氧化损伤，从而减轻辐射对小鼠睾丸的损伤。此外，氢气还显示出对生殖细胞凋亡的保护作用，维持了干精原细胞的活力。


Unisense微电极测定系统的应用


Unisense微电极被用于测定小鼠体内氢气（H2）的浓度。首先将富氢盐水注射到小鼠体内，然后使用Unisense氢气微电极测量了注射后小鼠睾丸中的氢气浓度。通过测量老鼠体内氢气浓度，能够探讨氢气如何通过减少羟基自由基（.OH）的产生来发挥辐射防护作用。


实验结果


研究结果表明，氢气能够显著降低辐射过程中产生的羟基自由基水平，减少脂质过氧化、蛋白质羰基化和DNA氧化损伤，从而减轻辐射对小鼠睾丸的损伤。此外，氢气还显示出对生殖细胞凋亡的保护作用，维持了干精原细胞的活力。氢气处理改善了辐射引起的睾丸组织形态学变化，并减少了通过TUNEL检测到的凋亡现象，表明氢气对生殖细胞具有保护作用。与现有的辐射防护剂（如WR-2721）相比，氢气没有显示出任何已知的毒副作用，这使其成为一种潜在的安全防护手段。

图1、自旋捕获识别了H2还原的.OH。(A)在无细胞体系中，H2溶解在23℃和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(10mM)溶液中，过饱和富氢盐水(0.8mM)稀释至0.4和0.2mM。作为.OH与DMPO的标准反应，在35mM DMPO的存在下，在0.1mM H2O2和0.03mM亚铁的混合物中通过Fenton反应产生.OH，并将溶液置于ESR测量仪(EMX-8)中进行测量。为了获得不同浓度H2下.DMPO-OH自由基的光谱，ESR扫描了30秒，累计六次。(B)对每个独立组的.DMPO-OH自由基信号进行半定量分析，以对照组百分比的第二个峰值表示。

图2、使用HPF检测H2O放射性分解产生的.OH。(A)辐射剂量与辐射溶解中荧光增加之间的关系。在无细胞体系中，将HPF探针[最终浓度为10µM，0.1%DMF(二甲基甲酰胺)作为辅助溶剂]加入23℃和pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，分别用5、10和20Gy剂量的γ-射线照射，照射速度为2Gy/min，以获得标准曲线。使用荧光显微镜获取荧光图像。荧光强度是在515nm波长和490nm波长的激发下测定的。基线显示的是没有HPF时的荧光。(B)荧光强度由每个独立组(n=3)的试样进行半定量。

图3、腹腔注射富氢盐水可增加睾丸中的H2浓度。经腹腔注入0.01ml/g的富氢生理盐水。用水合氯醛(0.35mg/g)麻醉小鼠，使其仰卧。将H2微电极(直径50μm)插入睾丸300μm深处。注入睾丸后5min和10min(相对于0min)，H2浓度(µM)增加(n=6)。

图4、腹腔注射富含氢气的生理盐水可降低IR期间的.OH水平。(A)在5Gy剂量辐射前20min，麻醉小鼠睾丸内注射HPF(15µl，25µM)，辐射前5min腹腔注射富氢盐水(0.01ml/g)。照射后，迅速从麻醉小鼠体内取出组织，包埋在OCT复合物中，准备冷冻切片(8μm厚切片)。用荧光显微镜获得具有代表性的睾丸荧光图像。基线1和2显示了有辐射时(1)和无辐射时(2)的荧光(在没有HPF和H2的情况下)。(B)在每个独立实验中，对冷冻切片中的HPF荧光进行半定量分析。通过比较不同组间睾丸的相对荧光强度来分析获得的图像(n=6)。

图5、H2保护睾丸内源性抗氧化剂，减少红外线对睾丸的氧化损伤。(A)5Gy剂量辐射4小时后，非辐射对照组、仅H2组、辐射+生理盐水组和辐射+H2组SOD活性和GSH浓度的变化。(B)用夹心ELISA免疫反应评估5Gy剂量照射4小时后未照射对照组、仅H2组、辐射+生理盐水组和辐射+H2组中脂质、蛋白质和DNA中氧化应激的标记物，如MDA、蛋白质羰基和8-OHdG(n=6)。


结论与展望


H2(氢气)具有作为一种新型辐射防护剂的潜力，而且没有已知的毒副作用。本研究旨在探讨H2的潜在辐射防护机制及其对辐照生殖细胞的保护作用。通过芬顿反应和H2O的辐射分解产生的羟自由基(.OH)被确定为被H2还原的自由基物种。研究人员使用了unisense的H2微电极动态检测体内H2的浓度，发现H2能显著降低羟苯基荧光素的原位荧光强度。由于Unisense微电极是一种高精度的传感器，能够准确测量溶解在溶液或生物组织中的气体浓度。通过测量注射富氢盐水后小鼠睾丸中氢气的浓度，研究者能够评估氢气对辐射诱导的生殖细胞损伤的保护效果。这是因为氢气的浓度可能与其抗氧化和辐射防护能力直接相关。但是由于在照射后用H2处理小鼠，因此降低的幅度并不明显。研究发现将H2预处理为IR(电离辐射)可明显抑制。OH与细胞大分子的反应，这种反应会导致脂质过氧化、蛋白质羰基和DNA氧化损伤。通过睾丸组织形态学变化和TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP nick-end标记)检查发现的凋亡现象有所改善，以及通过睾丸组织学参数、每日精子生成量和精子质量检查发现的干精原细胞存活率保持不变，都证明了H2对男性生殖细胞的辐射保护作用。使用WR-2721[S-2-(3-氨基丙基氨基)乙基硫代磷酸]作为参考化合物。研究结果首次在体内证明了H2通过中和辐照组织中的-OH起到辐射保护作用，且无副作用。这项研究首次在体内证明了氢气通过中和辐照组织中的羟基自由基起到辐射保护作用，且无副作用。这一发现为氢气作为辐射防护剂的潜在应用提供了重要的实验依据，并为未来保护暴露于辐射环境下的男性生育能力提供了新的策略。