研究简介:PGDH是一种关键的酶，负责控制子宫内前列腺素的水平，而前列腺素在分娩的生理过程中起到至关重要的作用。硫化氢是一种内源性的气体信号分子，参与了许多生理和病理过程，但其在分娩过程中的确切作用尚不明确。确定了硫化氢生成酶，包括半胱氨酸β-合成酶（CBS）和半胱氨酸γ-裂解酶（CSE），在人类蜕膜中的表达，并发现在分娩期间，无论是足月还是早产，这些酶的表达量都有所下降。此外研究还发现硫化氢的产生率在分娩期间也有所降低，并且CBS的表达水平与PGDH的表达呈正相关。为了进一步探究硫化氢对PGDH表达的影响，研究者们使用了硫化氢供体NaHS和硫化氢前体L-半胱氨酸来处理蜕膜滋养层细胞，并观察到PGDH的表达和活性随之增加。研究揭示了miR-26b和miR-199a这两种微小RNA在硫化氢上调PGDH表达中的作用，硫化氢能够抑制这两种微小RNA的表达，而这两种微小RNA的模拟物能够阻断硫化氢对PGDH表达的上调作用。本研究提供了硫化氢在维持妊娠期间蜕膜中PGDH表达稳定性中的关键作用的证据，并指出硫化氢生成酶表达的降低可能导致分娩期间子宫内前列腺素水平的增加，这可能与早产的发生有关。


Unisense硫化氢微电极系统的应用


将约100mg的胎盘组织放入含有蛋白酶抑制剂(2mmol/L苯基甲基磺酰氟、1mmol/L正钒酸钠和10μg/mL阿普丁)的磷酸盐缓冲液中，置于冰上。将组织匀浆并在4℃下离心，然后收集上清液。使用微型硫化氢微呼吸电极(型号H2S-MRCh；Unisense，丹麦)和Unisense PA2000放大器测定硫化氢产生的实时动力学。测量是在温控微呼吸室(Unisense)中进行的。传感器信号稳定后，加入L-半胱氨酸(1毫摩尔/升)和生成硫化氢的辅助因子吡哆醛-5’-磷酸(1mmol/L)。然后在每个痕量的最初最陡斜坡处测定硫化氢产生率。


实验结果


硫化氢在妊娠期间维持蜕膜中PGDH表达稳定性的关键作用。研究显示在足月和早产期间，蜕膜中硫化氢生成酶CBS和CSE的表达量降低，与非分娩期相比，硫化氢的产生率也有所下降。这种下降与PGDH表达的降低有关，暗示硫化氢生成酶的活性可能对PGDH的水平有直接影响。硫化氢供体NaHS和硫化氢前体L-半胱氨酸能够在培养的蜕膜滋养层细胞中剂量依赖性地增加PGDH的表达和活性。揭示了miR-26b和miR-199a在硫化氢调控PGDH表达中的潜在作用。硫化氢能够抑制这两种微小RNA的表达，而这两种微小RNA的模拟物能够阻断硫化氢对PGDH表达的上调作用，表明它们可能参与了硫化氢对PGDH表达的调控。

图1、γ-半胱氨酸合成酶(CSE)和β-半胱氨酸合成酶(CBS)在人胎膜中的定位。A和B：免疫组化分析显示CSE(A)和CBS(B)阳性染色的代表性切片。C和D：使用一抗得到的阴性对照切片被过量的相应肽预吸收。箭头表示阳性染色。原始放大倍数，200(A-D)。AE：羊膜上皮；CT：绒毛滋养层；DC：蜕膜。

图2、足月(TL)、非足月(TNL)和早产(PTL)绒毛组织中γ-半胱氨酸合成酶(CSE)和β-半胱氨酸合成酶(CBS)的表达、硫化氢产生率以及15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)与CSE或CBS的相关性。绒毛组织取自TNL(24人)、TL(24人)或PTL(21人)时的单胎妊娠妇女。图2A-C：TNL、TL和PTL绒毛膜组织中CSE(A)、CBS(B)和PGDH(C)的蛋白表达。有代表性的蛋白条带显示在相应直方图的顶部。D：绒毛组织匀浆中硫化氢产生的代表性痕迹。E：TNL、TL和PTL绒毛膜组织的硫化氢产生率。F和G：绒毛组织中PGDH与CSE或CBS的相关性。

图3、硫化氢对培养的绒毛滋养层细胞中15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)表达和活性的影响。A-C：NaHS对PGDH mRNA(A)和蛋白(B)表达以及活性(C)的影响。用浓度不断增加的NaHS(10-5至10-4mol/L)处理细胞24小时。D-F：L-半胱氨酸对绒毛膜细胞中PGDH mRNA(D)、蛋白(E)和活性(F)表达的影响。用浓度不断增加的L-半胱氨酸(10-4至10-3mol/L)处理细胞24小时。G-I：DL-丙炔基甘氨酸(PAG)和氨基氧乙酸半盐酸盐(AOAA)对L-半胱氨酸刺激PGDH mRNA(G)和蛋白(H)表达及活性(I)的影响。在PAG和AOAA存在或不存在的情况下，用L-半胱氨酸(10-3mol/L)处理细胞24小时。J-L：β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸合成酶(CSE)在L-半胱氨酸刺激PGDH表达中的作用。用CSE siRNA、CBS siRNA或干扰siRNA转染细胞，然后用10-3mol/L L-半胱氨酸处理24小时。转染CSE siRNA(J)和CBS siRNA(K)的细胞中CBS和CSE的代表性表达。L-半胱氨酸对转染CSE siRNA和CBS siRNA细胞中PGDH表达的影响(L)。PGDH mRNA和蛋白的表达及活性分别通过实时RT-PCR、Western印迹分析和转化检测进行测定。


图4、miR-26b和miR-199a参与硫化氢对绒毛膜中15羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)表达的调控以及miR-26b和miR-199a的表达。A和B：含有PGDH 3’-非翻译区(UTR)及其3’-UTR突变核苷酸的报告基因的荧光素酶检测。在没有或有miR-26a、miR-26b和miR-199b模拟物的情况下，用上述报告物转染绒毛滋养细胞。使用双荧光素酶报告检测系统测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。C：miR-26b和miR-199a抑制剂及模拟物对PGDH表达的影响。用miR-26b和miR-199a抑制剂及模拟物处理绒毛滋养细胞24小时。D和E：硫化氢对miR-199a和miR-26b表达的影响。用L-半胱氨酸和NaHS处理细胞24小时。实时RT-PCR检测miR-199a(D)和miR-26(E)的水平。F和G：miR-26b和miR-199a模拟物对硫化氢调控PGDH表达的影响。在没有或有miR-26b(F)和miR-199a(G)模拟物的情况下，用L-半胱氨酸和NaHS处理细胞24小时。通过Western印迹分析测定PGDH蛋白表达。


结论与展望


绒毛膜NAD依赖性15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)在控制子宫内前列腺素的数量方面起着关键作用，并与分娩过程有关。之前的研究在胎膜中发现了产生硫化氢的β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸合成酶(CSE)。本轮的研究人员研究了硫化氢是否参与了分娩过程中绒毛膜中PGDH表达的调节。绒毛组织取自早产、足月或未足月的孕妇。与未足月组相比，足月组和早产儿组的CSE和CBS水平以及硫化氢产生率均呈下调趋势。CBS水平与绒毛膜中PGDH的表达相关。硫化氢供体NaHS和前体L-半胱氨酸剂量依赖性地刺激了培养的绒毛滋养细胞中PGDH的表达和活性。CBS抑制剂和CBS siRNA可阻断L-半胱氨酸的作用，而CSE抑制剂和CSE siRNA则不能。硫化氢处理抑制了绒毛滋养细胞中miR-26b和miR199a的表达，miR-26b和miR-199a模拟物阻断了硫化氢对PGDH表达的上调。研究结果表明，硫化氢在人类妊娠期间维持绒毛膜中PGDH的表达中起着关键作用。硫化氢生成酶表达的减少导致了分娩时子宫中前列腺素含量的增加。本研究中Unisense微呼吸系统被用来实时测量蜕膜组织样本中硫化氢的产生速率。帮助研究者能够准确地测定蜕膜组织中硫化氢的产生情况，并进一步分析硫化氢生成酶在分娩过程中的作用，特别是在足月和早产期间对PGDH表达的影响。研究者们认为硫化氢生成酶的表达降低可能是导致分娩期间子宫内前列腺素水平增加的原因之一，这可能与早产的发生有关。因此，硫化氢生成酶的活性和其对PGDH表达的调控可能成为预防早产的潜在治疗靶点。这项研究不仅为理解硫化氢在分娩过程中的作用提供了新的视角，而且为未来的妊娠相关疾病的治疗提供了可能的新策略。