研究简介:报道了一种新的甲烷氧化菌——Methylomonas denitrificans FJG1菌株，它能够在低氧条件下将甲烷氧化与硝酸盐还原耦合，并以一氧化二氮（N2O）作为最终产物释放。这项研究扩展了我们对好氧甲烷氧化菌在碳和氮循环中作用的理解，并为这些细菌在厌氧生态系统中的丰度和活性提供了新的解释。研究者使用微传感器测量和Illumina RNA-Seq技术，发现FJG1菌株在氧限制条件下能够激活之前未知的反硝化途径，并且这种途径的基因表达与硝酸盐的可用性有关。特别地，研究揭示了在低氧条件下，FJG1菌株能够利用甲烷作为电子供体，通过反硝化途径将硝酸盐还原为N2O，同时通过这一过程保存能量。本文章强调了这种代谢灵活性对好氧甲烷氧化菌在自然环境中生存和功能的重要性。


在氧限制的环境中，如油砂尾矿池、冻土土壤和高纬度泥炭土壤等，这些细菌可能通过耦合甲烷氧化和硝酸盐还原来维持其代谢活动，这不仅有助于减少温室气体甲烷的排放，也可能影响氮循环和N2O的产生。此外研究还发现了与甲烷氧化有关的pxmABC操纵子在低氧和硝酸盐存在的条件下表达上调，暗示了可能存在一种新型的甲烷单加氧酶，这可能在低氧条件下的甲烷代谢中发挥作用。同时，研究发现在低氧条件下，与氧结合的球蛋白表达水平上升，这可能是一种将稀缺氧气输送至甲烷单加氧酶的机制。这项研究不仅发现了一种新的甲烷氧化菌，还揭示了其在低氧条件下独特的代谢途径，这对理解微生物在全球元素循环中的作用具有重要意义。


Unisense微呼吸系统的应用


Unisense微呼吸系统（MicroRespiration,MR chamber）被用来测量和分析Methylomonas denitrificans sp.nov.strain FJG1在不同条件下的代谢活动，特别是氧气（O2）、甲烷（CH4）、一氧化二氮（N2O）的消耗和产生情况。首先从在NMS（硝酸盐矿物盐培养基）或AMS（铵矿物盐培养基）中培养了120小时的细菌培养物中收集大约1×1011个细胞。使用过滤装置和0.2μm的滤膜收集细胞，然后用新鲜的矿物盐培养基洗涤三次，并重新悬浮在10 ml的培养基中。将洗涤后的细胞转移到10 ml的unisense的MicroRespiration（MR）微呼吸瓶中，不留任何空隙。MR室配备了OX-MR O2传感器和N2O-500 N2O传感器。通过直接注射的方式向MR室内添加硝酸盐（NO3−，最终浓度1 mM）、亚硝酸盐（NO2−，最终浓度1mM）和一氧化氮供体（ProliNONOate，每2.5分钟6 nmol）。在实验过程中，监测O2和N2O浓度变化，以评估细胞在不同条件下的代谢活动。


实验结果


揭示了一种新型的好氧甲烷氧化菌——Methylomonas denitrificans FJG1菌株，它在低氧条件下展现出了将甲烷氧化与硝酸盐还原耦合的能力，最终产生一氧化二氮（N2O）。FJG1菌株能够利用甲烷作为电子供体，在缺氧条件下将硝酸盐还原为N2O，这一过程表明了甲烷氧化菌在氮循环中的潜在作用。N2O的形成依赖于硝酸盐的可用性和低氧条件，这表明了环境因素对甲烷氧化菌代谢途径的重要影响。在氧限制条件下，FJG1菌株通过反硝化途径进行能量保存，这为理解这类细菌在低氧环境中的生存策略提供了新的视角。转录组分析显示，与反硝化途径相关的基因在缺氧和硝酸盐存在的条件下表达上调，这证实了生理和分子层面上对代谢途径的调控。

图1、Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T在AMS和NMS培养基中培养时的生长、甲烷和氧气消耗以及一氧化二氮产生。M.denitrificans sp.nov.株FJG1T在封闭的玻璃瓶中以100 ml的AMS或NMS培养基培养120小时，瓶盖为丁基橡胶隔膜帽，气体头空间的混合比例为3:7，甲烷对氧气。使用平板阅读器在600 nm处测量光密度（A），并使用气相色谱-热导检测器（GC-TCD）测量气体头空间中的甲烷（B）、氧气（C）和一氧化二氮（D）浓度。所有数据点表示n=6的平均值±标准差。

图2.Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T在氧气限制条件下将甲烷氧化与硝酸盐、亚硝酸盐和一氧化氮还原耦合。实验在封闭的10 ml微呼吸室中进行，该室配备了氧气和一氧化氮或一氧化二氮微传感器，并使用SensorTrace Basic软件记录数据。氧气（黑色三角形）和一氧化二氮/一氧化氮（灰色菱形）。箭头标记了甲烷、硝酸钾（1 mM）、CCCP（200μM）、亚硝酸钠（1 mM）或Proli NONOate（每2.5分钟6 nmol/注射）的添加时间。

图3、在<50 nM氧气条件下，硝酸盐还原为一氧化二氮依赖于甲烷。实验在封闭的10 ml微呼吸瓶中进行，该室配备了氧气和一氧化二氮微传感器，并使用SensorTrace Basic软件记录数据。氧气（黑色钻石）和一氧化二氮（灰色正方形）。箭头标记了甲烷的添加时间。

图4.在氧气限制条件下，Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T的ATP产生和氧气消耗。Methylomonas denitrificans sp.nov.株FJG1T在100 ml的NMS培养基中培养，在封闭的250 ml玻璃瓶中进行120小时，气体头空间混合比例为3:7，甲烷对氧气。柱状图表示ATP含量（黑色-AMS，灰色-NMS），线条表示气体头空间中的氧气浓度（AMS-黑色正方形，NMS-灰色三角形）。使用BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay(Promega)在发光度计上测量ATP，并使用GC-TCD测量气体头空间中的氧气浓度。每个数据点代表n=6的平均值±标准差。


结论与展望


属于Gammaproteobacteria门的专性甲烷氧化菌Methylomonas denitrificans新种FJG1菌株能够在氧气限制条件下将甲烷氧化与硝酸盐还原耦合，并以一氧化二氮（N2O）作为最终产物释放。虽然一些好氧甲烷氧化菌的基因组编码了假定的氮氧化物还原酶，但这些代谢模块是否用于NOx解毒、反硝化或其他目的尚不清楚。本研究通过unisense微呼吸传感器测量证明FJG1菌株在低氧条件下能够进行上述耦合反应。Illumina RNA-Seq数据分析揭示了FJG1菌株响应低氧条件的基因表达差异，包括之前未知的反硝化途径的基因以及pxmABC操纵子。生理和转录组数据表明，编码反硝化途径的遗传库存仅在氧限制条件下硝酸盐可用时才会上调。Unisense微呼吸系统为研究Methylomonas denitrificans FJG1菌株在低氧条件下的代谢途径提供了一个强有力的实验工具，unisense微呼吸传感器能够精确测量微呼吸瓶内的气体消耗和产生速率，这对于了解FJG1菌株在特定条件下的代谢活性和效率至关重要。支持了FJG1菌株在低氧条件下通过反硝化途径进行能量代谢的假设，使得研究人员能够在受控的微环境中详细监测和分析细菌的代谢活动。此外，ATP水平的定量表明，反硝化途径使用诸如硝酸盐还原酶NarGH等库存，使FJG1菌株能够在氧限制期间保存能量。本研究揭示了好氧甲烷氧化菌在碳和氮循环代谢交叉点的意外代谢灵活性。