研究简介:细胞衰老加剧是导致衰老和多种疾病的主要原因之一。衰老的特点是持续的细胞周期停滞和各种细胞独特的促炎分泌表型，这创造了衰老微环境（SME），在负反馈循环中驱动组织功能障碍恶化，从而降低自我修复能力组织。氢分子(H2)由于其抗氧化能力，可以选择性清除羟基等高氧化性/毒性自由基，已被证明是一种新兴的安全、有效和广谱抗炎剂。由于衰老与氧化应激密切相关，H2被发现对许多细胞（骨髓间充质干细胞成纤维细胞）和内皮组织具有抗衰老作用，且无明显毒副作用，表现出良好的抗衰老选择性和普适性。然而，衰老/损伤叠加衰老比个体衰老或损伤引起的衰老严重得多，并且H2对衰老骨损伤引起的衰老/损伤并发衰老的影响目前尚不清楚。此外，此前报道的H2抗衰老给药途径主要是口服富氢水和吸入氢气，无法长期达到高H2浓度。由于H2的溶解度低且分散度高，其在病变部位的持续时间较长，导致抗衰老功效有限。


本研究首先揭示了持续H2供应对于重塑老化骨中SME的必要性，然后设计了一种聚羟基脂肪酸酯（PHA）封装的CaSi2纳米粒子（CSN）负载介孔生物活性玻璃（MBG）支架（CSN PHA-MBG）用于局部持续（长达1周）释放高剂量H 2（911 mL/g CSN），实现有效重塑SME并增强受损老化骨骼的修复。研究发现了SME重塑修复损伤老化骨的机制，持续的H 2治疗普遍减轻了SME中的氧化应激，并通过抗炎途径有效地重塑了各种衰老细胞的SASP，诱导巨噬细胞复极化至抗炎表型、骨髓间充质干细胞募集、血管生成和成骨，支持受损的老化骨修复。


Unisense微呼吸系统的应用


通过氢气电极（Unisense，丹麦）检测CSN和CSN PHA-MBG在PBS缓冲液（pH 7.4）中的氢气释放行为，并根据预先建立的氢气浓度计算氢气浓度氢溶解水梯度浓度的氢校准曲线。


实验结果


揭示了持续H2供应对于重塑老化骨中SME的必要性，然后设计了一种聚羟基脂肪酸酯（PHA）封装的CaSi 2纳米粒子（CSN）负载介孔生物活性玻璃（MBG）支架（CSN PHA-MBG）用于局部持续（长达1周）释放高剂量H2（911 mL/g CSN），实现有效重塑SME并增强受损老化骨骼的修复。CSN的储氢能力比水高4.6×104倍，CSN PHA的持续释氢能力（约1周）远高于富氢水（约30分钟）。发现了SME重塑修复损伤老化骨的机制，持续的H2治疗普遍减轻了SME中的氧化应激，并通过抗炎途径有效地重塑了各种衰老细胞的SASP，诱导巨噬细胞复极化至抗炎表型、骨髓间充质干细胞募集、血管生成和成骨，支持受损的老化骨修复。

图1、可持续H2处理衰老骨中的各种衰老细胞的体外抗炎和抗衰老行为。(a)测试持续H2治疗对从老化骨骼中收集的BMSC、巨噬细胞和骨细胞的影响的示意图;（b）代表性衰老生物标志物的测量（ROS、HO-1、p16、p21、Ki67、BMSC、巨噬细胞和骨细胞中的γ-H2A.X、TAF、SA-β-gal、IL-6和IL-1β）在有或没有H2的情况下持续培养7天;(c)说明细胞衰老特征以及H2对SME调节的抗衰老、抗炎和再生保护作用。

图2、CSN和CSN PHA-MBG支架的结构和释氢行为。CSN的代表性SEM(a)和元素映射(b)图像、CSN和CaSi 2原材料的XRD图谱(c)、CSN PHA的代表性SEM和元素映射图像(d)、SEM图像不同放大倍数的CSN PHA-MBG支架的H 2释放曲线，以及CSN含量为1 mg·mL−1产率。所有实验独立重复3次，结果相似。

图3、支架治疗7天后老化骨缺损部位的SASP成分分析。(a)细胞因子阵列分析实验设计的示意图；(b)代表性小鼠细胞因子阵列图像(c)相应的定量（n=2个生物学独立样本）(d)通过ELISA测量的细胞因子水平。

图4、使用CSN PHA-MBG支架修复老化骨缺损的结果。（a）用钙黄绿素（绿色）和茜素红S(红色)对骨形成进行连续荧光标记；（b）并对矿物质沉积率进行相应的定量分析(n=8个生物学独立样本),(c)对新组织进行组织学检查第14天和第28天指定治疗后的老化骨缺损部位，(d)对照、PHA-MBG或CSN PHA-MBG治疗后第28天的新组织代表性SRμCT图像；(e)相应的BV/TV量化、(f)Tb.Th和(g)Tb.N（n=3个生物学独立样本）；(h)代表性免疫染色图像以及(i)p16（红色）、Vpp3（红色）的相应量化数据）。(j)指定治疗后第28天新组织中的Osterix（白色）和Emcn（绿色）表达（n=4个生物学独立样本,说明氢介导的损伤老化骨再生机制，其中局部和持续的H<b0>CSN PHA-MBG支架的释放通过诱导有效的抗炎（巨噬细胞极化）和普遍的抗衰老来重塑SME，从而促进MSC的募集并保留其再生能力。

图5、PBS中CSN PHA-MBG和CSN累积H2释放量的定量。CSN PHA-MBG和CSN均含有等量的CSN(1mg mL-1)1).由于H2在PBS中的溶解度低，24 h内快速从CSN中释放出来，因此H2从溶液中溢出，导致H2的累积量有显著差异。在CSN PHA-MBG和CSN之间释放。


结论与展望


衰老微环境会导致持续炎症和内在再生能力丧失，是老年人有效组织修复的主要障碍。在这项工作中，研究人员发现局部H2供应可以通过骨骼成熟骨的各种衰老细胞的抗炎和抗衰老作用来重塑衰老微环境。研究人员构建了一种H 2释放支架，通过电喷雾聚羟基脂肪酸酯封装的CaSi 2，将纳米颗粒附着到介孔生物活性玻璃上可以释放高剂量的H2（911 mL/g，长达1周）。在老年小鼠模型中展示了微环境的有效重塑和临界尺寸骨缺损的增强修复。从机制上讲，本研究揭示了局部H2释放通过衰老巨噬细胞复极化和分泌组变化将微环境从促炎症改变为抗炎症。相关研究结果还表明，H2可以减轻衰老/损伤叠加衰老的进展，促进内源细胞的募集并保留其再生能力，从而创造一个能够支持骨缺损再生的促再生微环境。研究关于局部H2释放策略为骨再生提供了一种有前景的抗衰老方法。