目的:研究一氧化氮(NO)对豚鼠左心室流出道自发电活动的影响及其对缺血/再灌注(I/R)时自发电活动改变的影响。方法:采用标准玻璃微电极细胞内电位记录技术观测外源性NO供体硝普钠(SNP)对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响及其对I/R时该电位改变的影响。结果:1、10、100μmol/L SNP呈浓度依赖性地导致4相自动除极速度(VDD)和自发放电频率(RPF)明显增加，但1 000μmol/L SNP的效应不明显。SNP呈浓度依赖性地导致最大舒张电位(MDP)绝对值和动作电位幅度(APA)增大，0相最大除极速度(V(max))加快，复极50%和90%时间(APD(50)和APD(90))缩短。缺血10 min组VDD和RPF明显减慢，APA和V(max)明显增大，APD(50)和APD(90)明显延长。与缺血10 min组相比，再灌注10 min组VDD和RPF明显加快，且常出现节律不齐，MDP绝对值和APA明显减小，APD(50)和APD(90)明显缩短。1、10、100μmol/L SNP再灌注时可明显改善缺血造成的VDD和RPF减慢以及再灌注造成的节律不齐，1 000μmol/L SNP的上述效应不明显。各浓度SNP再灌注时均可使缺血造成的APA和APD的改变恢复至对照组水平。结论:SNP可呈浓度依赖性地增加左心室流出道的自律性，并可明显改善I/R导致的自发慢反应电位的改变。


哺乳类的心室流出道在发生上由动脉球(心球)演化而来，在鱼及两栖类动脉球是位于心室之后的一个独立兴奋和收缩单位，在人胚早期仍有动脉球阶段。课题组前期的研究中发现，在豚鼠、大鼠及兔流出道的特定部位存在慢反应自律细胞，并和动脉球一样具有自动兴奋的能力。缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)常可导致心律失常，其中90%的特发性室性心动过速(idiopathic ventricular tachyarrhythmia，IVT)起源于右心室流出道，说明心室流出道部位自律细胞的电生理特性可能与源于流出道心律失常的发生机制有关。心脏I/R时，一氧化氮(nitric oxide，NO)合成的恢复或给予外源性NO很可能拮抗I/R诱导的损伤。为探讨NO对I/R时心室流出道电生理特性的影响，本研究应用玻璃微电极细胞内电位记录技术，采用停灌/复灌方法模拟I/R，记录并分析外源性NO供体硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)对I/R离体左心室流出道标本自发慢反应电位的影响。


材料和方法


1标本制备


健康豚鼠，250～350 g，急性处死后迅速开胸取出心脏，并用O2饱和的改良Locke液(mmol/L;NaCl 157，KCl 5.6，CaCl22.1，NaHCO31.8，葡萄糖5.6，pH 7.3～7.4)经冠脉进行灌注冲洗，左心室流出道标本制备参见文献。制好的标本用不锈钢针固定于灌流槽(1.5 cm×2 cm)内的硅橡胶上。用Ο2饱和的改良Locke液进行恒温(35℃±1℃)、恒速(10 mL/min)灌流，标本在灌流液中稳定30 min后开始实验。


2电位引导


采用常规玻璃微电极细胞内电位记录技术，引导左心室流出道部位的自发慢反应电位。如能直接记录到自发电位，则不再进行刺激，若记录不到，则将刺激电极置于标本远离瓣膜一端的心肌组织上，给予波宽2 ms、1 Hz、2倍阈强度的方波刺激，刺激时间由数秒至数分钟不等，直至诱发出稳定的自发节律，即停止电刺激开始实验。引导出的自发慢反应电位，经SWF-1B型高阻抗微电极放大器放大，一路输入监听器监听，另一路采用RM6280多道生理信号采集处理系统，自动显示电信号，并分析自发慢反应电位的各项参数指标。


3观测指标


4相自动除极速度(velocity of diastolic depolarization，VDD)、自发放电频率(rate of pacemaker firing，RPF)、最大舒张电位(maximal diastolic potential，MDP)、0相最大除极速度(maximal rate of depolarization，Vmax)、动作电位幅度(amplitude of action potential，APA)、复极50%时间(50%of duration of action potential，APD50)和APD90。


4实验过程和分组


待自发节律稳定30 min后，开始采集一组正常的自发慢反应电位作对照，然后采用一定浓度的药液进行灌流，实时记录并分析各种因素对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响。为保证药效，各种药液均在实验前1 h内配制。实验分组如下:(1)SNP对豚鼠左心室流出道自律性电活动的影响研究:SNP分为4个浓度组:1、10、100、1 000μmol/L SNP组，每个浓度组灌流10 min;(2)SNP对I/R豚鼠左心室流出道自律性电活动改变的影响研究:采集对照自发慢反应电位，停灌10 min待电位出现明显改变后，再分别以含有1、10、100、1 000μmol/L SNP的灌流液再灌10 min，分别记录对照组、停灌10 min组(I 10 min)和不同浓度SNP再灌10 min组(SNP+R 10 min)自发慢反应电位的改变;(3)I/R时豚鼠左心室流出道自律性电活动的改变研究:采集对照自发慢反应电位，停灌10 min模拟缺血，然后以正常灌流液再灌，分别记录对照组、停灌10 min组(I 10 min)、再灌10 min组(R 10min)自发慢反应电位的改变，作为SNP对I/R电生理效应的对照。


5统计学处理


数据以均数±标准差(mean±SD)表示，给药前后各项指标采用自身配对t检验，应用SPSS 15.0统计软件对数据进行处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。


结果


1 SNP对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响


SNP可呈浓度依赖性导致左心室流出道自发慢反应电位VDD和RPF逐渐加快，100μmol/L SNP组达最大效应，1 000μmol/L SNP组VDD和RPF的加快效应不明显。各个浓度SNP灌流过程中，自发节律平稳规整。冲洗10 min，自发节律恢复至给药前水平，见图1、2。

图1 SNP对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响


1、10和100μmol/L SNP灌流10 min，RPF与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)，1 000μmol/L SNP组RPF相对于对照组无明显加快。与10μmol/L SNP组相比，100μmol/L SNP组RPF明显加快(P＜0.05)。


10和100μmol/L SNP灌流10 min，VDD与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)，但1μmol/L SNP组VDD与对照组相比无明显改变。1 000μmol/L SNP组VDD与对照组相比无明显加快，与100μmol/L SNP组相比反而明显减慢(P＜0.05)。


与对照组相比，MDP绝对值呈浓度依赖性增大，1～1000μmo/L SNP均可使VPA增大，Vmax呈浓度依赖性加快，以1 000μmol/L SNP效应最明显，100和1 000μmol/L SNP组APD50和APD90显著缩短，其中APD90的缩短更明显(P＜0.01)，见图1、2。


2 SNP对I/R过程中左心室流出道自发慢反应电位改变的影响


2.1SNP对I/R过程中VDD和RPF改变的影响与对照组相比，各个实验组缺血10 min组VDD和RPF均显著减慢(P＜0.05)。缺血10 min后SNP再灌，与缺血10 min组相比，10和100μmol/L SNP+R组VDD明显加快(P＜0.05)，1、10和100μmol/L SNP+R组RPF明显加快(P＜0.05)，但与对照组相比无显著差异，VDD和RPF逐渐恢复至对照组水平。1 000μmol/L SNP+R组对缺血10 min组的VDD和RPF减慢无明显影响。SNP改善缺血10 min引起的VDD和RPF改变也呈现浓度依赖性，以100μmol/L SNP+R组效应最明显，1 000μmol/L SNP+R组反而相对较弱，见图3、4。


缺血10 min后正常灌流液再灌，再灌注2 min组VDD和RPF明显加快，与对照组和缺血10 min组相比均有显著差异，且再灌注至5 min的过程中，自发节律不稳定，容易出现节律不齐，有二联律、三联律的出现。再灌注10 min组VDD和RPF明显减慢(P＜0.05)，RPF恢复至接近对照组水平，VDD与对照组相比仍明显加快(P＜0.05)。各个浓度SNP+R过程中，很少出现节律不齐，自发节律平稳规整(数据未显示)。


2.2SNP对I/R过程中MDP、Vmax和APA改变的影响与对照组相比，缺血10 min组MDP绝对值和APA均有所增大，Vmax加快，部分表现为差异显著(P＜0.05)。与缺血10 min组相比，正常灌流液再灌注10 min组MDP绝对值和APA明显减小(P＜0.05)，Vmax明显减慢(P＜0.05)，MDP绝对值和APA恢复至对照组水平。


与缺血10 min组相比，1μmol/L SNP+R组和100μmol/L SNP+R组MDP绝对值明显减小(P＜0.05)，1和1 000μmol/L SNP+R组APA明显减小(P＜0.05)，而100μmol/L SNP+R组APA反而明显增大(P＜0.05)，Vmax变化不明显，见图3、4。

图2 SNP对豚鼠左心室流出道自发慢反应电位各项参数指标的影响

图3 SNP对I/R豚鼠左心室流出道自发慢反应电位的影响

图4 SNP对I/R豚鼠左心室流出道自发慢反应电位各项参数指标的影响



2.3SNP对I/R过程中APD50和APD90改变的影响


与对照组相比，各个实验组缺血10 min组APD50明显延长(P＜0.05)。与缺血10 min组相比，正常灌流液、再灌注10 min组以及1、10和100μmol/L SNP+R组APD50均显著缩短(P＜0.05)，恢复至对照组水平。1 000μmol/L SNP+R组APD50恢复不明显，见图4。


与对照组相比，各个实验组缺血10 min组APD90明显延长(P＜0.05)。与缺血10 min组相比，各个浓度SNP+R组APD90均显著缩短(P＜0.05)。与缺血10 min组相比，正常灌流液再灌注10 min组APD90也显著缩短(P＜0.01)，见图4。