研究简介:在膜生物膜生物反应器(MBfRs)中进行的好氧甲烷氧化-反硝化(AME-D)为同时减少甲烷(CH4)排放和去除废水中的硝酸盐提供了良好的前景。然而关于氧分压如何影响反扩散生物膜的发育和特性、其空间分层特征以及生物膜微生物之间的协同作用等方面的系统实验研究尚缺乏。在本研究中，研究人员首次将光学相干层析成像(OCT)与共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)相结合，原位表征了MBfR中反扩散生物膜的发展。结果表明，MBfR上的氧分压能够控制生物膜的厚度和空间分层，进而控制功能微生物的分布。在优化的氧气分压5.5 psig(含氧量25%)条件下，AME-D工艺反扩散生物膜的反硝化效率最高，主要原因是该生物膜在好氧层和缺氧层之间具有良好的动态平衡，好氧层中有合适的氧气梯度和足够的好氧甲烷养菌，有利于甲烷氧化。


保留完全消耗的O2和可获得的有机源，避免限制缺氧层的反硝化活性。通过宏基因组分析和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)染色，成功证实了反扩散生物膜内功能微生物的空间分布，发现典型的好氧反硝化菌Rhodocyclaceae在好氧层中存活并逐渐富集，在好氧反硝化过程中起着关键作用。该原位生物膜可视化和表征首次直接证明了AME-D在反扩散生物膜中的协同反硝化路径，包括好氧甲烷营养菌、异养好氧反硝化菌和异养缺氧反硝化菌。


Unisense微电极系统的应用


通过使用微电极传感器（OX-10，Unisense，丹麦）原位测量沿着生物膜深度的DO浓度梯度，该传感器与皮安计连接用于数据采集。在如前所述测量DO分布之前，用无氧和饱和水校准尖端直径为10μm的微传感器，将微电极安装在马达驱动的微操纵器上，使用Sensor Trace Pro软件精确控制该微操纵器，电机驱动微传感器沿生物膜厚度方向以5μm的深度步进从膜表面向本体液推进，控制微传感器15 s达到稳态，获得溶解氧浓度分布的深度剖面，然后测量15 s，在每个位置收集5个重复样品，再向前移动到下一个位置。利用解剖显微镜进行可视化观察，以估计微传感器与生物膜的相对位置，并选择每个生物膜的顶部、中部和底部3个位置进行测量，以确保数据的重复性。


实验结果


在反扩散生物膜AME-D工艺中，膜腔内的氧分压通过操纵生物膜发育过程和空间特性对反硝化性能产生显著影响。CLSM和OCT观察结果表明，当氧分压从1.1 psig增加到5.5 psig时，生物膜的定殖和积累速度加快，成熟时间相对较长后形成较厚的生物膜。当进一步增加到6.6 psig时，过量的供氧会导致形成的生物膜呈颗粒状团聚。微电极测量和FISH图像分析表明，在氧分压为5.5psig时，反扩散生物膜的反硝化性能最好，这主要是由于好氧层和缺氧层之间的动态平衡达到最佳，此时氧分压为5.5psig，有利于反硝化菌的脱氮。红环菌科倾向于生活在好氧层，在好氧反硝化过程中起主要作用，为AME-D过程由好氧甲烷营养菌、异养好氧反硝化菌和异养缺氧反硝化菌共同进行的新型协同机制提供了证据。

图1、通过结合OCT和CLSM观察，在不同氧分压下生物膜时间发展的显微可视化。（a）、（c）、（e）和（g）分别基于堆叠CLSM图像的阶段I至IV的微生物覆盖因子;（B）、（d）、（f）和（h）相应阶段的生物膜厚度，基于原地OCT观察。

图2、不同氧分压下生物膜微生物组成的变化：基于16s rRNA基因高通量测序的关键微生物群落在科水平上的相对丰度。

图3、不同氧分压下MBfRs中生物膜EPS含量的变化。

图4、在MBfRs运行期间在不同氧分压下的反硝化性能。（a）-MBfR出水中NO3−-N的浓度;（B）表面NO3−-的变化根据方程式S1计算的氮去除通量;（c）在每个阶段结束时MBfR中的DO浓度;（d）每一阶段结束时所有MBfR的TOC浓度。

图5、(a)利用微电极监测不同氧分压下MBfR生物膜内平均溶解氧分布的深度剖面图，0μm处的点代表生物膜底部，误差线表示多次测量的标准偏差（n个（B）氧分压对好氧/缺氧层生物膜分层的影响;（c）三重叠加FISH图像，显示反扩散生物膜中I型和II型好氧甲烷氧化菌和反硝化菌的空间分布。生物膜样品通过Cy3标记（Mγ84和Mγ705的混合物，红色）对I型好氧甲烷氧化菌染色，通过FAM标记（Mγ450，绿色）对II型好氧甲烷氧化菌染色，反硝化菌用Cy 5-标记（DEN 67和TBD 1419的混合物，蓝色），紫色表示I型甲烷氧化菌和反硝化菌的重叠，蓝色表示II型甲烷氧化菌和反硝化菌的重叠。


结论与展望


本研究揭示了不同氧分压下AME-D工艺中生物膜的动态发展特征，探讨生物协同反硝化机理，在实验室规模的6个不同氧分压下平行运行MBfR，比较了不同氧分压下MBfR的生物膜发育和反硝化性能.通过结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和光学相干性，在原位目视评价生物膜形态特征的动态差异体层摄影(OCT)，然后生物膜的组成包括胞外聚合物（EPS）和16 SrRNA分析其次利用微电极和荧光技术研究了生物膜空间分层对氧分压的响应。最后通过宏基因组分析，揭示了AME-D工艺中甲烷氧化和反硝化的协同作用，为反扩散MBfR的生物膜管理和分层提供了直观的证据，而且鉴定了AME-D工艺中的实际微生物，这对沼气生物反应器的开发和应用，以及对AME-D工艺的深入理解具有重要意义。