囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)是最常见的一种常染色体隐性遗传病，其病因是囊性纤维化跨膜传导调节因子的基因突变导致大量黏液阻塞全身外分泌腺，临床表现为慢性阻塞性肺疾病、胰腺功能不全及汗腺受累所致的汗液钠、氯异常增高等。铜绿假单胞菌风是引起广泛急性和慢性感染的机会致病菌。研究表明，感染的局部往往有显著的炎症反应，尤其是大量的中性粒细胞在发病部位聚集。本论文主要就慢性假单胞菌肺感染的囊性纤维化患者的痰液中的氧化亚氮进行相关测试，研究不同患者痰液中的氧化亚氮的浓度来探索这类患者产生疾病的原因，从而为治愈和预防这类疾病提供新的策略。


Unisense微电极系统的应用


应用unisense氧微电极（OX-25）结合使用马达控制系统测试了单胞菌肺感染的囊性纤维化患者的痰液样本中的氧气剖面浓度分布情况；随后应用unisense氧化亚氮微电极（N2O-25）结合使用马达控制系统自动测试了肺感染患者痰液中的氧化亚氮（12个小时内）的垂直浓度剖面图，使用自动马达测试时，每次的测试步径为100um或200um。


实验结果


研究表明铜绿假单胞菌慢性肺部感染是囊性纤维化(CF)患者的主要严重并发症，在低氧条件下，铜绿假单胞菌在支气管内黏液生物膜中持续生长。大量的多形核白细胞(PMNs)围绕着生物膜通过消耗大量氧气来产生活性氧(ROS)，从而产生局部缺氧。从7例慢性铜绿假单胞菌感染患者的8例痰液标本中，应用电化学微传感器测量N2O和O2。用格里斯试剂（一氧化氮测定试剂盒）估算痰液中NO3 2-和N2O的浓度。我们发现患者痰液中N2O最大浓度为41.8 mM(range1.4-157.9 mM N2O)。在痰液中的N2O浓度高于氧合层中的N2O的浓度。在4个样本中，N2O浓度在最初的6小时内呈上升趋势，在约6小时后下降，而在潜伏期24小时内，痰液中的NO3 2-浓度出现降低。

图1、应用微电极测试痰液中的氧气和氧化亚氮的化学浓度梯度分布情况。图a表示的是应用微电极插入囊性纤维化绿脓杆菌肺部感染患者的痰液样本测试示意图。图b表示是痰液中氧气和氧化亚氮浓度的分布剖面图。图c表示的是介绍了在CF痰液中涉及的多形核白细胞（PMN）和生物膜产生反硝化过程的示意图。

图2、痰液体系中的氧气和氧化亚氮分配情况。图A表示的是慢性假单胞菌肺感染型囊性纤维化患者痰标本中含氧区域的深度。图B表示的是慢性假单胞菌肺感染型囊性纤维化患者痰(n=8)标本中好氧区和缺氧区中N2O的最大浓度(n=8)，对比组采用两名PCD患者和一名CF患者，患者肺部没有感染慢性假单胞菌。

图3、痰液样本中不同时间段内的氧化亚氮和氧气的浓度剖面分析图。慢性假单胞菌肺部感染囊性纤维化患者典型痰标本中N2O浓度剖面的分布图，从图中显示可以看出，缺氧区N2O的浓度初始累积增加，随着时间的增加，氧化氧氮表现为全消耗。在实验开始时，痰液标本中氧浓度剖面分布情况是对三个微剖面的平均值。从图中可以看出，痰液标本中缺氧区的氧化亚氮的浓度在0~6.5h内是表现为逐渐增加的，在6.5h~11.6h后表现为逐渐减小。

图4、痰液样本中不同深度的N2O的生产和消耗速率。从图中可以看出，相同的痰液样本中，N2O浓度与时间的深度特异性图。在痰液样本中所有深度中，N2O的净产量都是大约6小时后被观察到，其次是N2O的净消耗，大概是在6 h左右的发现了硝酸盐的消耗。

图5、从痰标本中累积N2O的流出和排放。图A表示的是积累和排放的氧化亚氮的微剖面图(n=4)，计算出囊性纤维化患者痰液样品中N2O流出率，图B表示的是基于N2O微剖面图(n=4)计算出的N2O排放率，I、II、III和IV分别代表4种不同的痰液样本。


总结


本论文首次在临床研究中测试出从受感染的人类气道中产生的N2O的浓度分布情况。研究过程中使用了unisense的氧化亚氮微电极和氧微电极正确的测试了患者的痰液中的氧化亚氮和氧剖面浓度分布情况，从而了解到这样的现象产生的原因是基于反硝化作用的致病性代谢引起的。因为铜绿假单胞菌可通过在囊性纤维化(CF)患者的缺氧内支气管黏液中进行反硝化，获取能量。论文研究中正是微电极的使用很好的监测出痰液样本中的氧浓度分布剖面，从而确认痰液的低氧区和好氧区域，从而进一步测试痰液在低氧区的氧化亚氮的生产和硝化情况。从而获得慢性假单胞菌肺感染的囊性纤维化患者痰中氧化亚氮的产生的机理，正是因为体系中无氧生长的能力造成了慢性铜绿假单胞菌感染的关键因素，该理论的提出也为今后的治疗和预防提供新的策略。这也说明了unisense微电极系统在肺感染研究领域也存在着非常好的应用前景。