氢气(H2)无色无味，是自然界最小的分子，同时也是宇宙中含量最多的元素。过去H2被认为是生物惰性气体。近年来，随着对其生物学功能的深入研究，研究人员认为H2可能是继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氢(H2S)之后又一个重要的气体信号分子。2007年Ohsawa等发现氢气可显著改善脑缺血再灌注损伤，由此引起了对于氢气的研究热潮。研究表明，H2对多种人类疾病和病理状态都具有明显的缓解和治疗效果，如氢分子在抗氧化、抗炎症等方面都发挥着重要作用。此外，H2在植物学上也具有重要的生理作用，其不仅可提高植物对生物/非生物胁迫的抗性，还参与调控植物的生长发育。


目前饮用富氢水(hydrogen-rich water，HRW)是常用的摄取氢的方式，水相中氢气浓度的准确测定是各项研究以及后续生产应用的前提和基础。


目前，测定溶液中氢气浓度的方法主要有电极法、气相色谱法和氧化还原滴定法。电极法是通过测定溶液中氧化还原电位的变化而确定溶液中氢气的浓度；气相色谱法主要依据样品成分与色谱柱沸点、极性或吸附性的不同，气体通过色谱柱时被分离，各种物质到达检测器时间有所不同，从而可以对待测组分进行定性和定量测定；氧化还原滴定法是利用亚甲基蓝在胶体铂催化下与氢气发生氧化还原反应使亚甲基蓝褪色，通过亚甲基蓝的用量计算出溶液中氢气的含量，但此方法误差较大，且准确度不高。


基于此，本研究利用氢气微电极和检测小体系溶液中氢气浓度的可行性，以期建立一种可广泛用于氢气生物学研究和相关产品研发的氢气浓度检测方法。


实验材料与仪器设备


标准氮气、氧气购自北京诚为信气体有限公司。Milli-Q Advantage A10纯水设备购自美国Millipore公司；ZK-300纯水氢气发生器购自北京中科汇恒技术开发有限公司；氢气微电极购自丹麦Unisense公司，SH-RtTM-Msieve 5A色谱柱；气相色谱瓶购自美国安捷伦科技有限公司。


饱和HRW的制备


将纯水氢气发生器制得的氢气(99.999%)通入100 mL超纯水(ddH2O)中以制备HRW，每隔10 min使用氢气微电极测定一次，直至饱和，氢气在20℃下溶解度为1.62 mg·L-1[20]。制得饱和HRW后，立即使用ddH2O稀释，配制成不同浓度的HRW(表1)以用于测定标准曲线，溶液总体系为500.0μL。

表1高浓度和低浓度HRW配制


电极法测定HRW中氢气浓度


电极极化


将氢气微电极浸泡于ddH2O中，电极极化电压设置为1 000 mV，随后逐渐下降，并最终稳定在某一数值，待此数值稳定10 min以上后，电极极化结束，可以开始样品检测。电极极化时间一般需要1～2 h。


样品检测


将500μL不同浓度的HRW置于1.5 mL离心管中，将电极插入液面以下，待信号值稳定后，记录数据。


结果


电极法测定水相中氢气浓度


标准曲线

利用氢气微电极分别测定高浓度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低浓度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氢气的浓度。以水相中氢气浓度为纵坐标，以氢电极的信号值为横坐标，绘制标准曲线。如图1A所示，高浓度HRW标准曲线方程为y=0.001 402x-0.028 35，相关系数(R2)为0.999 8；如图1B所示，低浓度HRW标准曲线方程为y=0.001 580x-0.030 28，R2=0.999 7。因此，低浓度、高浓度HRW中，水相中氢气浓度与氢气微电极信号值之间均具有良好的线性关系。

图1氢电极法检测水相中氢气浓度标准曲线


精确度分析及检出限分析

利用氢气微电极对某一高浓度(0.72 mg·L-1)、低浓度(0.012 mg·L-1)样品进行9次平行测定，对该测定方法进行精确度分析，由表2可知在0～1.620 0 mg·L-1范围内，该方法的标准偏差为0.012 9 mg·L-1，变异系数为1.775 3%。结果表明该方法精确度较高，满足水相中高浓度氢气的测定要求。

表2电极法检测高浓度和低浓度HRW的精确度分析


由表2可知,在0～0.202 5 mg·L-1范围内，用电极法测定低浓度HRW的样品的标准偏差为0.001 3 mg·L-1，变异系数为11.734 0%。根据1.5中的公式，t(8,1-a=0.99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0.99)=0.004 4 mg·L-1。表明该方法精确度较高，满足水相中低浓度氢气的测定要求。


综上所述，对于需要实时监测的样品，使用氢微电极法较为合适。从检测方式来看，电极法可以直接实时监测水相中氢气的浓度；但从测定原理来看，电极法根据溶液中氧化还原电位的变化而测定溶液中氢气的含量，由于生物样本成分较为复杂，电极法的测定结果容易受到多种因素的干扰。