离子通道结构和功能的研究需综合应用各种技术,包括:电压和电流钳位技术、单通道电流记录技术、通道蛋白分离、纯化等生化技术、人工膜离子通道重建技术、通道药物学、基因重组技术及一些物理和化学技术。

1、电压钳位技术

一般而言,膜对某种离子通透性的变化是膜电位和时间的函数。通过玻璃微电极与细胞膜之间形成紧密封接,利用电子学技术施加一跨膜电压并把膜电位固定于某一数值,可以测定该膜电位条件下离子电流随时间变化的动态过程。利用药物或改变细胞内外的溶液成分,使其他离子通道失效,即可测定被研究的某种离子通道的功能性参量,分析离子电流的稳态和动力学与膜电位、离子浓度等之间的关系,可推断该种通道的电导、活化和失活速率、离子选择性等,并能测量和分析通道的门控电流的特性。

2、单通道电流记录技术

又称膜片钳位技术,用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面,使之形成10~100GΩ的密封(giga-seal),被孤立的小膜片面积为μm2量级,内中仅有少数离子通道。然后对该膜片实行电压钳位,可测量单个离子通道开放产生的pA(10-12安培)量级的电流,这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化,可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量,并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来,以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。

3、通道药物学研究

应用电压钳位或单通道电流记录技术,可分别于不同时间、不同部位(膜内侧或外侧)施用各种浓度的药物,研究它们对通道各种功能的影响。结合对药物分子结构的了解,不但可以深入了解药物和毒素对人和动物生理功能作用的机制,还可以从分子水平得到通道功能亚单位的类型和构象等信息。

4、通蛋离、通建和基重术

利用与通道特异结合的毒剂标记,可把通道蛋白质从膜上分离下来,经过纯化,可以测定各亚单位多肽的分子量。然后,把它们加入人工膜,可重新恢复通道功能。用于确定蛋白质氨基酸序列的基因重组技术的程序是:从细胞中分离出含有与该种通道蛋白相关的mRNA,置入某种细胞(如大肠杆菌),经逆转录得到cDNA。用限制性内切酶将cDNA切割成特定片段,再用核酸杂交方法钓出特定的DNA并克隆化。通过测定阳性克隆DNA的核苷酸顺序,推断出相应的蛋白质氨基酸序列。