【摘要】：细胞电融合技术自从由Zimmermann发明以来，就因为效率高、可控性强、操作简便、重复性好、对细胞无毒害等优点而得到广泛应用，逐渐成为现代生物工程技术中的一个重要工具，被广泛应用于物种产生或改良、单克隆抗体制备、癌症免疫治疗等领域。本文运用现代微机电系统(micro electro mechanical systems，MEMS)加工技术在厘米见方的基底材料上制作了微电极阵列细胞电融合芯片。所包含的微电极对数达到103数量级，微电极间距小于100μm。同时，研究开发了细胞电融合仪，可以与芯片集成为高通量细胞电融合系统，并利用介电电泳和细胞电致穿孔原理实现细胞操控和电融合。细胞定位、穿孔及挤压操作是细胞电融合的基础。因此，本文首先对细胞操控和电融合原理进行了深入的探讨，在此基础上运用有限元方法分析了不同形状、分布的微电极阵列在外加电压条件下的电场分布，并以此为据来优化微电极和微电极阵列设计，以获得有利于细胞电融合的电场环境。在此期间确定了矩形梳状交叉微电极阵列芯片模型。


随后，对芯片加工工艺、材料、封装技术等进行了研究，成功研制了硅基底-硅微电极、玻璃基底-硅微电极、硅基底-全金属微电极、电路板(printed circuit board，PCB)微电极等四种不同材料的细胞电融合芯片。同时，研制开发了细胞电融合仪。最后，在芯片和融合仪组成的高通量细胞电融合平台上进行了微生物、动物、植物细胞电融合实验。


具体来说，论文研究工作主要包括以下几个方面:


1.芯片上微电极尺寸及分布对电场强度及梯度的影响。在细胞融合芯片上，三维微电极的几何及分布参数包括微电极厚度、宽度、深度、纵向间隔、横向间隔，微电极尖端几何形状(直角形齿、锥形齿、平行板)，电极排列方式(对称性和非对称型)等。这些参数的改变都会对微通道中的电场强度及梯度产生影响。通过有限元方法，对微电极阵列进行了建模仿真。根据细胞电融合的要求，提出了一种有利于细胞电融合的矩形梳状交叉微电极阵列芯片模型，为实现高效细胞电融合奠定了理论基础。在该芯片中，可以产生有利于细胞电融合的电场环境，提高对细胞的操控能力和融合率。


2.芯片和微电极材料及制作工艺的选择。为了使细胞电融合芯片获得最佳的电气和生化性能，本文研究了全硅微电极、硅玻结合(玻璃基底加硅微电极)、硅基底全金属微电极、PCB铜电极等四种芯片，包括其微电极和微通道设计、加工工艺选择、封装设计和材料选择等。


3.细胞电融合仪的设计及制作。在研究了细胞电融合过程中涉及到的细胞操作，即排队、电穿孔、挤压等三个基本过程及所需电信号特征后，提出了用单频正弦信号和双向归零高压脉冲信号作为细胞电融合的最佳操控与穿孔信号。在此基础上，设计了信号产生电路、智能控制电路、显示电路、高压电源电路并进行相应的软件编写、PCB设计、电子装配与调试，参数测试等，获得了可以提供高通量细胞电融合所需电信号的细胞电融合仪，其技术指标达到国内先进水平。


4.细胞电融合实验研究。利用新研制的芯片和融合仪建立了细胞电融合实验平台，开展了微生物(酵母细胞)、动物(HEK-293、鸡血细胞)、植物(烟草叶肉原生质体)细胞的排队或融合实验。结果表明，芯片内数量巨大微电极(103对/cm2数量级)可以同时操控大量细胞来完成排队和电穿孔，从而实现高通量电融合。另一方面，由于微电极间距小到微米数量级，细胞操作和融合所需电压很低，如细胞排队电压(Vpp)在6 V左右即可达到满意效果，电穿孔脉冲电压幅值也小于60 V。这样，融合电压的降低提高了细胞电融合系统安全性，也降低了电融合仪的设计要求和生产成本。通过一系列分析、仿真及实验研究，使芯片内微电极的设计、选材及加工工艺得以优化，可以产生更有利于细胞电融合的电场和电场梯度分布。实验结果表明，芯片上的细胞电融合可以获得较高的电融合率。以烟草叶肉原生质体的电融合为例，其融合率最高达到50.2%。动物细胞HEK-293的融合率最高也达39.1%，酵母细胞最高达33.4%，这些都较传统的利用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)的化学融合方法的融合率(1%)和传统电融合仪器上的融合率(10%)高出很多。总之，通过对细胞电融合芯片电极设计以及电学特性的研究，研制出高通量、高融合率的细胞电融合芯片，并根据细胞电融合过程和所需电信号要求，研制开发出智能化细胞电融合仪。集成融合芯片及电融合仪建立了细胞电融合微系统实验平台，在对微生物、动物、植物原生质体等细胞的电融合实验中，取得了很好的实验效果。该研究为实现细胞电融合系统微型化、建立高效、自动的细胞融合芯片实验室奠定了良好的基础。