随着高通量技术的发展，我们对微生物的认识逐步深入，微生物在临床以及科研上的应用越来越多，而微生物采样的正确与否直接关系到微生物数据的准确性。因此，微生物的采样方法就显得格外重要。

首先，我们需要在取样的过程中，注意以下几个方面：


(1)所有实验用到的取样用具必须是经过灭菌的（如样品袋、取样器、采血管、试管、铲子、匙、刀类工具等）。


(2)收集样品信息，取样前或取样后应在盛装样品的容器或样品袋上立即贴上标签，每件样品必须标记清楚（例如品名、来源、数量、取样地点、取样人及取样日期等）。


(3)请尽量将样本分装3-5份备份；建议每组取6个及以上重复较为合适，至少3个重复。


(4)用到谷禾取样管的实验样品，可以常温运输；如果不用取样管，则必须低温-80℃保存，保存期间切忌反复冻融；低温寄送时请将样品置于泡沫箱中，用干冰寄送。


然而样品种类繁多，不同的样品取样有不同的方案，下面详细介绍每类样品对应的取样方案。


环境微生物


普通土壤


(1)去除表面浮土、凋落物等，根据土壤情况，选择是否过2mm筛网，每个样品从3个及以上采样点采集并混合而成，建议将样本分装3-5份备份；


注：采样时需注意每个采样点的取土深度及采样量应均匀一致，土样上层与下层的比例要相同。


(2)保存于无菌离心管中，置于泡沫箱（冰袋或干冰）中，0°C以下运回实验室；


(3)如果条件不允许立即提DNA，可将样品置于-80°C冰箱中保存，并通过干冰寄送至公司后提取样品总DNA。



根际土壤


根际，是指受植物根系活动影响，在物理、化学和生物学性质上不同于土体的那部分微域环境。部分研究是针对土壤微生物与植物之间的相互关系，因此需要对根际土进行取样。


(1)采集植株，去除根周较松散的土，仍附着在根系表面的视为根际土。将植物置于装有冰袋或干冰的保温箱中，避光条件，0℃以下运回实验室；


(2)准备无菌容器，将植物根系部分置于缓冲液（PBS或生理盐水）中震荡，震荡时间和强度依据样本实际情况调整，洗下根际土；


(3)将洗涤液进行高速离心，收集土壤沉淀，若沉淀较少，也可过滤膜，同一样方取样的样本进行多点等量混合；


(4)将样本分装至离心管中，密封，标记样本信息后液氮速冻，置于-80℃冰箱保存，干冰寄送。


水体沉积物、底泥


采集水底沉积物5~10 g（具体深度依据实验目的确定），保存于冻存管中，标记好样本信息后液氮速冻或置于装有干冰的泡沫盒中，黑暗环境下，尽快运回实验室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。


活性污泥


多点取样并等量均匀混合至约10 ml的悬浮污泥样本（5~10 g沉降物），保存至冻存管中，标记好样本信息后液氮速冻或置于装有干冰的泡沫盒中，黑暗环境下，尽快运回实验室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。


水体


(1)采集水样应注意无菌操作，以防止杂菌混入。


(2)根据实验设置，选取适当孔径的滤膜，使用水体抽滤机抽滤1~100 L水体（不同水质间差异极大），或抽滤至滤膜上可见明显覆盖物。


对于浑浊水体，建议过滤前静置分离悬浮颗粒物，先用大孔径滤膜过滤一遍，再用小孔径滤膜过滤。


(3)标记好样本信息后液氮速冻或置于装有干冰的泡沫盒中，黑暗环境下，尽快运回实验室，-80℃冰箱保存，干冰寄送。


注：根据水体中微生物含量不同，取样量有所不同：污水等菌群丰富的水体用量一般为200-1000 ml，湖泊、河流等自然水体一般为1-2 L，自来水等菌群含量较低的水体则一般为1-5 L，海洋水体随着地理位置、季节和取样深度浮动较大。


食品


包装食品


尽可能取原包装，检验前不要开封，以防污染。


大块冷冻食品，应从几个不同部位用灭菌工具取样，使样品具有充分的代表性；


在将样品送达实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不能再冻，保持冷却即可。


液体食品


通常情况下，液态食品较容易获得代表性样品。


盛放在大罐中的液态食品（如牛奶、奶昔、饮料等），取样时可连续或间歇搅拌；


盛放在小容器的液态食品，可在取样前将液体上下颠倒，使其完全混匀。较大的样品要放在已灭菌的容器中送往实验室。实验室在取样检测之前应将液体再彻底混匀一次。


对于牛奶、葡萄酒、植物油等，常采用虹吸法（或用长形吸管）按不同深度分层取样，并混匀。如样品粘稠或含有固体悬浮物或不均匀液体应充分搅匀后，方可取样。


半固体食品


用无菌操作开启包装，此类样品无法用吸管吸取，可用无菌勺子从不同部位挖取样品，放入无菌盛样容器。若样品是粉末，应边取边混合。


固体食品


面粉或奶粉等易于混匀的食品，其成品质量均匀、稳定，可以抽取小样品（如100g）检测。但散装样品必须从多个点取大样，且每个样品都要单独处理，在检测前要彻底混匀，并从中取一份样品进行检测。


肉类、鱼类或类似的食品既要在表皮取样又要在深层取样。深层取样时要小心不要被表面污染，同时避免使之暴露在空气当中。


有些食品，如鲜肉或熟肉可用灭菌的解剖刀和钳子取样；冷冻食品可在未解冻的状态下可用锯子、木钻或电钻（一般斜角钻入）等获取深层样品；全蛋粉等粉末状样品取样时，可用灭菌的取样器斜角插入箱底，样品填满取样器后提出箱外，再用灭菌小勺从上、中、下部位取样。




注：


·注意不要使固体样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌滋生。


·食品如为非冷藏易腐食品，应迅速将所取样品冷却至0℃~4℃；若样品是冷冻的，应保持冷冻状态，低温寄送。


植物内生菌


植物内生细菌是植物微生态系统中的重要组成部分，直接对植物组织样本进行测序分析，可以研究植物内生细菌或真菌的多样性。


(1)根据研究对象选取新鲜植物组织（如果是植物根部，需去除根表粘附土壤）；0℃以下运回实验室；


(2)根据组织大小剪成小块或小段（至少两边不超过0.5cm），在无菌工作台内，用无菌水对植物组织进行洗涤30s；


(3)表面无菌化处理：


第一次消毒：75%无水乙醇浸泡1min；第二次消毒：2%次氯酸钠处理3min，转入75%无水乙醇浸泡30s，接着用无菌水漂洗3次；


(4)进行核酸提取实验或液氮速冻，放置-80℃冰箱保存。干冰寄送。


动物肠道内容物


(1)用无菌手术刀挖取（或无菌镊子挤出，也可用无菌生理盐水冲洗出）肠道内容物；


(2)直接用谷禾取样盒里的棉签沾取约黄豆大小的肠道内容物，将沾取内容物的棉签浸入取样管液体搅拌洗脱内容物进入取样管保存液内；搅拌约30-40s，然后丢掉棉签，将管子盖子拧好，快速摇晃取样管至少30秒；


(3)观察到管内液体带有明显肠道内容物颜色即取样成功，常温寄送。


人和其它动物粪便


(1)使用前请洗净双手，防止杂菌干扰。将取样管取出，拧开盖子。


(2)用取样棉签沾取少量新鲜粪便(需要量为黄豆一绿豆大小)；如粪便较干，可先将棉签在取样管中浸湿后沾取；


(3)将沾取粪便的棉签浸入取样管液体搅拌洗脱粪便进入取样管保存液内，搅拌约30-40s，然后丢掉棉拭子，将管子盖子拧好，快速摇晃取样管至少30秒；


(4)观察到管内液体带有明显粪便颜色即取样成功，常温寄送。




注：


·如3天内使用过抗生素类、质子泵类胃药、阿片类精神药物请停药3天后再检测。


·感冒、腹泻或其他症状期间不影响取样,拉稀或稀便可以用棉签反复沾取粪便至取样管。


·如长期便秘无排便可使用开塞露等辅助手段获取粪便样本。


·取样无时间和饮食限制,但是取样前最好正常饮食。


·完成取样后样本可常温有效存储一周,为保证检测时效请完成取样后尽快送回。


口腔


口腔拭子


(1)采样前30分钟禁食、禁烟酒等；


(2)准备一杯清水（约150ml），将清水含入口中，充分洗漱口腔约10秒，重复2-3次。


(3)将拭子伸入口腔，使拭子头充分接触左侧口腔内壁，上下牙床处粘膜，用适当力度上下擦动并旋转拭子15-20圈。用同样方法在右侧口腔内壁及上下牙床粘膜处进行另一根拭子的采样。


(4)将拭子置入取样管保存液内，搅拌约30-40s，然后丢掉拭子，将管子盖子拧好，快速摇晃取样管至少30秒；常温寄送。


咽拭子


(1)采样前30分钟禁食、禁烟酒等；


(2)准备一杯清水（约150ml），将清水含入口中，充分洗漱口腔约10秒，重复2-3次。


(3)将采集对象舌头外拉，使悬雍垂尽可能向外牵引。同时，将拭子越过舌根到咽后壁或者悬雍垂后侧，反复擦拭15次以上，避免接触舌、口腔粘膜和唾液。


(4)将拭子置入取样管保存液内，搅拌约30-40s，然后丢掉拭子，将管子盖子拧好，快速摇晃取样管至少30秒；常温寄送。


唾液取样


(1)采样前30分钟禁食、禁烟酒等；


(2)准备一杯清水（约150ml），将清水含入口中，充分洗漱口腔约10秒，重复2-3次。


(3)用舌尖抵住上颚或下颚齿根以富集唾液，向取样管中轻轻吐入唾液，直至液体唾液（非气泡）达到2ml以上。搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒；常温寄送。


牙菌斑取样


(1)采样前30分钟禁食、禁烟酒等；


(2)准备一杯清水（约150ml），将清水含入口中，充分洗漱口腔约10秒，重复2-3次。


(3)用棉卷隔湿所采集的牙齿，再以无菌生理盐水冲洗牙面，用无菌挖匙或探针采集窝沟菌斑或唇颊面菌斑；以牙线置于两邻牙之间，紧贴牙面采集邻面菌斑。采集后放入含有保存液的取样管内，搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒；常温寄送。


皮肤


一、样本筛选


如果受试者存在以下情况，则需剔除：


(1)采样前7天，脸部，头皮，脖子，胳膊，前臂或者手使用过抗生素或者萜类物质者；


(2)脸部，胸部，背部或者肩膀有痤疮者；


(3)头皮，脸，脖子，手臂，前臂或者手上有水泡，脓疱，疮，脓肿，腐烂或者溃疡者；


(4)在取样部位处有一处水泡，脓疱，疮，脓肿，腐烂，溃疡，藓，伤口，裂纹或者色素及粉红色的皮肤修复区者；


(5)身上有多处粉色或红色皮肤区域者（暗指牛皮癣或者湿疹患者）；


(6)手掌或者脚掌皮肤增厚或者有裂纹者；


(7)两周之内，每天使用去屑洗发水都不能清理干净头皮屑者；


(8)身体一处或者多处有散发型皮疹者。


二、收集方法


(1)将拭子在无菌生理盐水或清水中浸湿，在实验目的区域擦拭10s；


(2)样本采集后立即将拭子置入取样管保存液内，搅拌约30-40s，然后丢掉拭子，将管子盖子拧好，快速摇晃取样管至少30秒；常温寄送。


人体其它部位


组织


(1)取相应部位组织样品，于无菌操作台上解剖，用灭菌剪刀、解剖刀切取指甲盖大小左右组织块；


(2)将组织块放入冻存管中并盖紧盖子，标记好样本信息。样品液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。


肺泡灌洗液


(1)口咽部进行雾化利多卡因麻醉后，滴注120-300mL无菌生理盐水进行BAL液体标本的收集。取样后离心，去掉上清，取沉淀物。


(2)用液氮速冻-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脱置取样管，搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒，常温寄送。


肠道灌洗液


(1)收集肠道灌洗液，过膜；或者将肠道灌洗液离心，弃上清，取沉淀物。


(2)用液氮速冻-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脱置取样管，搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒，常温寄送。


生殖道


(1)采用无菌棉拭子，沿着阴道口、阴道中部和后穹窿内腔壁旋转拭子做圆周运动数次。


(2)擦拭后立即将拭子浸入取样管中的保存液中，搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒，常温寄送。


血液


(1)成人10-20ml（儿童1-3ml）全血收集到真空采集管（已加入抗凝剂），上下颠倒两次。


(2)标记信息，低温保存，干冰寄送。


乳汁


(1)洗净双手，母乳期用无菌水擦拭乳头，取乳汁5-10ml 3管（除掉第一管）。


(2)低温（-20℃）保存，干冰寄送；或者用拭子沾取乳汁后，立即将拭子浸入取样管中的保存液中，搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒，常温寄送。


腹水


(1)收集腹水10-20ml，离心，弃上清，取沉淀物。


(2)用液氮速冻-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脱置我们的取样管，搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒，常温寄送。


胆汁


(1)胆汁样本由十二指肠引流法或胆囊穿刺法或手术中留取胆汁，采集胆汁量为5ml，置无菌管内，离心，弃上清，取沉淀物。


(2)用液氮速冻-80℃保存，干冰寄送；或取沉淀物洗脱置我们的取样管，搅拌约30-40s，快速摇晃取样管至少30秒，常温寄送。


尿液


(1)采集中段尿液40 ml左右。（中段尿：在排尿过程中，弃去前、后时段排出的尿液，以无菌容器收集）；


(2)一般留取清晨第一次尿液，最好憋尿6小时。住院患者可以直接取晨尿，患者将晨尿的中段尿收集至无菌杯中40 ml为宜；门诊患者或健康人等无尿意者，可以适量饮水，在有尿意时尽可能的多憋一段时间，将尿液的中段尿收集至无菌尿杯中40 ml为宜；


(3)离心，去上清，加入我们的液体保存，常温寄送。


注：


·应在抗生素使用前或停用抗生素药5天后留尿液标本。


·对于小便轻度失禁患者或者憋尿时间过长患者，对中段尿比较难控制的情况下，我们可以告知患者在排尿过程中3 s后采集尿液。


·如果是病危或昏迷病人，可由相关医务人员用导尿方法采集尿液，此操作过程中要严格执行无菌操作，避免因导尿不慎而导致的泌尿系统感染。也可以采用经下腹前壁膀胱穿刺取尿培养的方法。


以上是各类样品的取样方法，可供参考。


也许有人问，是否一定要用我们的取样管保存液，能不能用生理盐水或者别的来替代。下面是我们进行的关于保存液的测试：



经测试，使用谷禾取样管保存液，能在-80℃~65℃的条件下保持DNA完整性，室温有效储存长达30天，尽可能保证与新鲜样本具有一致的菌群构成特征。


要想得到较为理想的测序结果，首先样品的质量需要得到保障，当然样本提取、建库、分析对最终结果都会产生一定的影响，而取样同样重要。如果没有取好，后续分析再多，可能也得不到想要的结果。


另外，严谨的研究设计对于获得准确且有意义的结果也很重要，研究设计中应注意考虑混杂因素，如果在不确定的情况下，也可以适当咨询我们的技术顾问，结合我们的经验，给您合适的建议。


当然实验过程中，也可能会受到多种因素的影响，我们会采用阴性和阳性对照，尽可能减少这些不必要的影响。


总之，做好前期的准备工作，包括研究设计，取样等，后续的提取、测序、分析交给我们~


参考文献


[1]Edwards J,Johnson C,Christian Santos-Medellín,et al.Structure,variation,and assembly of the root-associated microbiomes of rice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2015,112(8).


[2]Bulgarelli D,Rott M,Schlaeppi K,et al.Revealing structure and assembly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota[J].Nature,2013,501(7468):S25.


[3]ISO 10381-6:2009 Soil quality-Sampling-Part 6:Guidance on the collection,handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes,biomass and diversity in the laboratory.


[4]Ruiz-González C,Niño-García J P,Kembel S W,et al.Identifying the core seed bank of a complex boreal bacterial metacommunity[J].The ISME journal,2017,11(9):2012.


[5]Wang Y,Ma L,Mao Y,et al.Comammox in drinking water systems[J].Water research,2017,116:332-341.


[6]Chow C E T,Winget D M,White III R A,et al.Combining genomic sequencing methods to explore viral diversity and reveal potential virus-host interactions[J].Frontiers in microbiology,2015,6:265.


[7]Yang Y,Li B,Zou S,et al.Fate of antibiotic resistance genes in sewage treatment plant revealed by metagenomic approach[J].Water research,2014,62:97-106.


[8]Pesant S,Not F,Picheral M,et al.Open science resources for the discovery and analysis of Tara Oceans data[J].Scientific data,2015,2.


[9]Ma J,Wang Z,Li H,et al.Metagenomes reveal microbial structures,functional potentials,and biofouling-related genes in a membrane bioreactor[J].Applied microbiology and biotechnology,2016,100(11):5109-5121.


[10]Liu J,Yang H,Zhao M,et al.Spatial distribution patterns of benthic microbial communities along the Pearl Estuary,China[J].Systematic and applied microbiology,2014,37(8):578-589.


[11]Mason O U,Scott N M,Gonzalez A,et al.Metagenomics reveals sediment microbial community response to Deepwater Horizon oil spill[J].The ISME journal,2014,8(7):1464.


[12]Bråte J,Logares R,Berney C,et al.Freshwater Perkinsea and marine-freshwater colonizations revealed by pyrosequencing and phylogeny of environmental rDNA[J].The ISME journal,2010,4(9):1144.


[13]Li J,Sung C Y J,Lee N,et al.Probiotics modulated gut microbiota suppresses hepatocellular carcinoma growth in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2016,113(9):E1306-E1315.


[14]Gebhart D,Lok S,Clare S,et al.A modified R-type bacteriocin specifically targeting Clostridium difficile prevents colonization of mice without affecting gut microbiota diversity[J].MBio,2015,6(2):e02368-14.


[15]Hänninen A,Toivonen R,Pöysti S,et al.Akkermansia muciniphila induces gut microbiota remodelling and controls islet autoimmunity in NOD mice[J].Gut,2018,67(8):1445-1453.


[16]Fujisaka S,Avila-Pacheco J,Soto M,et al.Diet,genetics,and the gut microbiome drive dynamic changes in plasma metabolites[J].Cell reports,2018,22(11):3072-3086.


[17]Agus A,Denizot J,Thévenot J,et al.Western diet induces a shift in microbiota composition enhancing susceptibility to Adherent-Invasive E.coli infection and intestinal inflammation[J].Scientific reports,2016,6:19032.


[18]Stanley D,Moore R J,Wong C H Y.An insight into intestinal mucosal microbiota disruption after stroke[J].Scientific reports,2018,8(1):568.


[19]Rabbi M F,Munyaka P M,Eissa N,et al.Human catestatin alters gut microbiota composition in mice[J].Frontiers in microbiology,2017,7:2151.


[20]Rabbi M F,Eissa N,Munyaka P M,et al.Reactivation of intestinal inflammation is suppressed by catestatin in a murine model of colitis via M1 macrophages and not the gut microbiota[J].Frontiers in immunology,2017,8:985.


[21]McInnes P,Cutting M.Manual of procedures for human microbiome project:Core microbiome sampling,protocol A,HMP protocol no.07-001,version 11.2010[J].Current version:https://www.hmpdacc.org/hmp/resources/HMP_MOP_Version12_0_072910.pdf


[22]Jie Z,Xia H,Zhong S L,et al.The gut microbiome in atherosclerotic cardiovascular disease[J].Nature communications,2017,8(1):845.


[23]Mar J S,LaMere B J,Lin D L,et al.Disease Severity and Immune Activity Relate to Distinct Interkingdom Gut Microbiome States in Ethnically Distinct Ulcerative Colitis Patients[J].mBio,2016,7(4).


[24]Sze M A,Baxter N T,Ruffin M T t,et al.Normalization of the microbiota in patients after treatment for colonic lesions[J].Microbiome,2017,5(1):150.


[25]Flemer B,Lynch D B,Brown J M,et al.Tumour-associated and non-tumour-associated microbiota in colorectal cancer[J].Gut,2017,66(4):633-43.