胰腺胰岛在移植后立即处于无血管状态。尽管胰岛迅速发生血管再生重建，但这种血管再生重建是否能对移植的胰岛组织提供充足的氧供尚不确定。我们在将小鼠或人胰岛移植到裸鼠体内1个月后，测量了其组织氧分压、血流量和血管密度。组织氧分压采用克拉克微电极测量。血液灌注采用激光多普勒血流细胞仪测量，而血管密度则通过凝集素巴西木（BS-1）染色的组织学标本确定。移植后的小鼠和人胰岛的氧分压均约为内源性小鼠胰岛的15–20%。此外，移植胰岛的血管密度低于内源性小鼠和人胰岛。移植物血液灌注量约为肾皮质血流量的50%。在人胰岛移植物中，供体年龄与血液灌注之间呈负相关。这些移植物的总血管密度与供体年龄之间也存在类似的相关性。总之，与内源性胰岛相比，移植的人胰岛血管密度和氧分压均显著降低。这对临床胰岛移植具有潜在意义，因为血管植入不良可能会显著增加获得胰岛素独立性所需的胰岛数量。


最近提出的埃德蒙顿方案表明，通过严格遵守某些标准（例如无类固醇免疫抑制方案），大多数胰岛移植的1型糖尿病患者可以实现胰岛素独立性。然而，胰岛移植的一个主要障碍是人胰岛组织的供应有限。因此，优化胰岛在植入器官中的植入效果以减少治愈糖尿病患者所需的胰岛数量具有极其重要的意义。尽管如此，关于移植胰岛是否发生充分的血管再生重建的研究却很少。正常情况下，胰腺胰岛具有复杂的肾小球样血管结构，确保胰岛的任何部分与动脉血液的距离不超过一个细胞。此外，动物研究表明，胰腺胰岛的血供明显高于外分泌胰腺，与肾皮质所见相似（约5–7 ml/min·g）。这种独特的毛细血管网络和高血液灌注对于向胰岛细胞高效输送氧气和营养物质以及优化分泌激素向靶器官的弥散是必需的。然而，当胰腺胰岛在移植前被分离和培养时，胰岛血管结构被破坏并发生去分化或退化。在移植后的即刻时期，胰岛仅通过周围组织中的血管以弥散方式获得氧气和营养物质的供应。


移植的胰岛在7–14天内完成血管再生重建，但动物研究引发了质疑：新形成的血管是否具有足够的能力来满足高代谢活性胰岛细胞的需求。我们此前已记录到同基因移植大鼠胰岛的氧分压和血液灌注显著降低。这种低氧分压和血液灌注是否也适用于移植的人胰岛尚不清楚。本研究旨在测量移植到无胸腺裸鼠体内的小鼠和人胰岛的组织氧分压和血管密度。此外，还测量了胰岛移植物的血液灌注，以研究人胰岛移植物的血管密度和/或血液灌注与供体年龄之间是否存在相关性。


材料与方法


动物


使用购自丹麦Ry的Bomholtgaard研究与繁殖中心的雄性C57BL/6和C57BL/6（nu/nu）小鼠，体重约25克。在整个研究过程中，动物可自由饮水和进食颗粒饲料。所有实验均经乌普萨拉动物伦理委员会批准。


胰岛分离与培养


来自7名心跳供体的人胰岛在比利时布鲁塞尔β细胞移植中心分离，并通过空运至乌普萨拉。器官供体的平均年龄为40±5岁（范围19–53岁）。胰岛分离及细胞活力（电子显微镜下86±3%）、胰岛细胞组成（57±4%胰岛素阳性细胞）和外分泌组织含量（<1%）的表征在布鲁塞尔按此前描述的方法进行。到达乌普萨拉后，胰岛在RPMI 1640培养基（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）中培养4–6天，培养基中添加5.6 mmol/L葡萄糖、10%（体积/体积）胎牛血清、0.17 mmol/L苄青霉素和0.17 mmol/L链霉素。此前已发现该培养基组成有利于培养人胰岛。雄性C57BL/6小鼠的胰腺胰岛通过胶原酶消化制备，并在RPMI 1640培养基中自由漂浮培养4–7天，培养基中添加11 mmol/L葡萄糖、10%（体积/体积）胎牛血清、0.17 mmol/L苄青霉素钠和0.17 mmol/L链霉素。每两天更换一次培养基。


胰岛移植


培养后，将200–250个小鼠胰岛或0.6 µL人胰岛装入制动移液管中，植入麻醉的C57BL/6（nu/nu）小鼠左肾包膜下。麻醉剂为阿佛丁[2.5%（体积/体积）溶液，含10克97%（体积/体积）2,2,2-三溴乙醇（Sigma）溶于10毫升2-甲基-2-丁醇（Kemila AB，瑞典斯德哥尔摩）]。两只小鼠接受来自同一人类供体的胰岛。


内源性和移植胰岛的氧分压测量


动物用阿佛丁麻醉（见上文），置于维持在体温（37°C）的手术台上，并进行气管切开术。将聚乙烯导管插入右侧颈动脉和左侧颈静脉。前者连接至Statham P23dB压力传感器（Statham Laboratories，美国加利福尼亚州洛杉矶）监测平均动脉血压，后者用于持续输注林格溶液（5 ml/kg·h）以补充体液丢失。


行左侧肋下侧腹切口，将携带移植物的左肾固定于塑料杯中。肾脏用浸泡于林格溶液的棉絮包裹，并覆盖矿物油（Apoteket，瑞典哥德堡）以防止蒸发，保持组织湿润和体温。使用改良的克拉克微电极（Unisense优尼森，丹麦奥胡斯）测量胰岛移植物和邻近肾实质的氧分压。电极（外径2–6 µm）在立体显微镜下通过显微操作器插入组织。在每个组织和动物中至少进行10次测量。计算每个动物中所有测量的平均值，视为一次实验。对于内源性胰腺胰岛的氧分压测量，暴露并固定胰腺，并以此前在大鼠中描述的方式观察其胰岛。在每个动物中，对三个或更多浅表胰腺胰岛及周围外分泌实质进行氧分压测量。通常在同一胰岛中进行多次测量；计算平均值以获得一个胰岛的氧分压值。然后，一个动物中胰岛氧分压值的平均值视为一次实验。在氧分压测量过程中，血压、体温和组织温度通过连接至Macintosh Power-PC 6100（Apple Computers，美国加利福尼亚州库比蒂诺）的MacLab仪器（AD Instruments，英国黑斯廷斯）持续记录。