我们进一步使用我们建立的亲电捕获测定法结合LC-MS/MS鉴定来证明磺酰叠氮的效率。简而言之，在Tris-HCl缓冲的10 mM H₂S溶液中用不同浓度的清除剂（以SS19为例）处理。在不同时间点，使用硫醇捕获亲电试剂β-(4-羟基苯基)乙基碘乙酰胺（HPE-IAM）或单溴二胺（MBB）捕获剩余的H₂S，并通过LC-MS/MS定量产物。如图5a、b所示，HPE-IAM和MBB测定均证明SS19可以在几分钟内完全去除H₂S。此外，SS19还在酶促硫化物生成系统中进行了测试。我们之前已证明CARS可以将半胱氨酸转化为半胱氨酸过硫化物，在此过程中H₂S通过过硫化物的还原分解形成。将CARS（在大肠杆菌中产生的重组蛋白，100 mg/mL）与Cys（100 mM）孵育10分钟。接下来应用SS19。然后通过HPE-IAM测定法分析H₂S含量。同样，我们观察到时间和浓度依赖性的H₂S清除（图5c）；半胱氨酸过硫化物水平也下降，但程度较低（图5d）。在该系统中H₂S的去除似乎比使用纯H₂S时慢。这可能是由于H₂S的酶促产生是一个缓慢但持续的过程。

图5. a）SS19处理的H₂S溶液中H₂S-HPE-IAM加合物浓度。b）SS19处理的H₂S溶液中H₂S-MBB加合物浓度。c）CARS系统中H₂S-HPE-IAM加合物浓度。d）CARS系统中半胱氨酸过硫化物-HPE-IAM浓度。


我们还分析了缓冲液中磺酰叠氮与H₂S之间的反应（支持信息，方案S1）。发现元素硫S₈和磺酰胺是产物。应该指出的是，芳基叠氮与H₂S之间的反应机制之前已被研究，发现瞬态H₂S₂是最终形成S₈的中间体。由于磺酰基比芳基具有更强的吸电子性质，磺酰叠氮的反应比芳基叠氮快得多。我们认为将H₂S转化为S₈是有用的，因为它不仅将高反应性和生物活性的H₂S转化为惰性物种（S₈），而且还产生了未来使用的H₂S储备池。


磺酰叠氮基清除剂在细胞系统中去除H₂S的效率进一步通过荧光测定法得到验证。例如，将H₂S（100 mM）加入细胞裂解液中显著增强了特定荧光探针WSP5的荧光强度，而添加SS17后观察到荧光强度的剂量依赖性衰减（支持信息，图S6）。细胞成像还显示，细胞内H₂S通过SS17预处理被有效降低（支持信息，图S7）。


为了证明清除剂可以减弱H₂S的生物学效应，采用了两种体外模型（癌症生长/炎症）。据报道，H₂S可诱导癌症（包括肝脏和舌头）生长，尤其是在H₂S水平高的细胞中。在第一个模型中，我们测试了清除剂对H₂S诱导的肝癌SNU398细胞生长的影响。如图6a所示，暴露于H₂S 24小时显著增强了细胞生长。然而，在H₂S暴露前用SS17预处理30分钟显著减弱了H₂S的作用。在第二个模型中，脂多糖（LPS）可以触发raw 264.7巨噬细胞的炎症，表现为TNF-α分泌增加。这种作用可以被H₂S显著降低，表明其抗炎作用。然而，当细胞用SS17预处理时，H₂S诱导的抗炎作用明显减弱（图6b）。我们还在这些细胞模型中测试了SS17的磺酰胺产物，发现它不影响细胞的反应（支持信息，图S8和S9）。这些结果证实了清除剂在消除H₂S诱导的生物学功能方面的效果。

图6. a）SS17对H₂S诱导的SNU398细胞生长的影响。细胞用H₂S处理24小时，有或没有（w/o）SS17预处理。b）SS17对H₂S抗炎作用的影响。Raw 264.7细胞用100 mM H₂S和/或100 mM SS17预处理30分钟，然后用1 mg/L LPS刺激24小时。数据显示为均值±标准误。n = 4。Con = 对照。


为了确定清除剂在体内的功效，我们检查了磺酰叠氮基清除剂（SS20）是否能拯救H₂S中毒的小鼠。H₂S是一种高度神经毒性的气体，急性H₂S暴露的幸存者可能会出现长期、通常是毁灭性的神经系统问题，包括永久性植物状态、记忆丧失、认知障碍、神经精神问题和运动障碍。H₂S被美国政府视为高优先级化学威胁，无论是工业上还是作为恐怖分子潜在的大规模杀伤性武器。目前，H₂S中毒没有解毒剂，治疗主要是支持性的。氰化物解毒剂HC已被测试作为H₂S解毒剂。它在动物模型中显示出一些益处，但必须在H₂S暴露之前或之后立即给药。HC用于H₂S中毒的临床使用仍然不成功。显然，新型H₂S解毒剂的识别是国家优先事项。我们相信强效H₂S清除剂可以作为潜在的解毒剂。因此，测试了清除剂（SS20）。简而言之，Na₂S（125 mg/kg）在腹腔（IP）注射给小鼠之前立即溶解在生理盐水中。在Na₂S注射后1分钟，通过IP注射给予SS20、HC或载体（0.5% DMSO在生理盐水中）。虽然7只载体处理的小鼠中有4只死亡（由人道终点确定），但所有用SS20或HC处理的小鼠在Na₂S注射后都存活了下来（图7）。这些结果表明，磺酰叠氮基清除剂有效地清除了体内的H₂S，可能代表了一类新的有效H₂S中毒解毒剂。

图7. H₂S中毒小鼠用SS20、HC或载体处理的存活率。\P < 0.05 vs. 载体。灰色\表示SS20和HC处理实验中各使用6只小鼠。黑色\表示载体处理实验中使用7只小鼠。


应该指出的是，在这项工作中，我们主要关注这些化合物清除H₂S的能力，而不是其他H₂S相关的硫物种，如H₂Sₙ和过硫化物。众所周知，H₂S生成酶（CBS、CSE、3MST和CARS）也产生H₂Sₙ和过硫化物，它们在生物系统中处于平衡状态。在实际的细胞系统中，游离半胱氨酸的存在应促进这些物种的相互转化，它们可能共同作用以发挥H₂S（或H₂Sₙ和过硫化物）的功能。事实上，我们观察到磺酰叠氮与半胱氨酸过硫化物反应，尽管与H₂S的反应相比速率明显较慢（图5d）。因为它们处于平衡状态，即使真正选择性的H₂S清除剂也会降低并最终消除给定系统中的所有这些硫物种。我们相信这些亲核含硫醇反应性硫物种的完全去除将有助于H₂S生物学效应的研究，并且对于开发H₂S中毒解毒剂是理想的。


结论


总之，强效H₂S清除剂的识别是该领域一个紧迫且未满足的需求。在这项工作中，我们系统地分析了已发表的H₂S荧光传感器数据，并选择/测试了一系列可能的清除剂。这种数据驱动的方法使我们能够快速发现磺酰叠氮作为非常有前景的清除剂。它们的H₂S清除能力在缓冲液、酶促系统和细胞环境中得到了证明。我们还在H₂S诱导的细胞增殖和抗炎模型以及小鼠H₂S中毒模型中验证了清除剂。我们预计这些高效的清除剂不仅将成为阐明H₂S生物学作用的有用工具，而且还将成为潜在的治疗剂，例如一类新的H₂S中毒解毒剂。