摘要


硫化氢（H₂S）是一种重要的信号分子，其上调和下调均具有特定的生物学后果。尽管近年来通过开发H₂S供体在H₂S上调方面取得了重大进展，但精确的H₂S下调仍然具有挑战性。缺乏强效且特异性的H₂S生成酶抑制剂是导致这一问题的原因。我们预计开发H₂S清除剂是解决这一问题的替代方法。由于H₂S微电极和清除剂具有相同的标准，我们构建了一个H₂S传感器数据库，总结了已报道传感器的关键参数。数据驱动分析筛选出30种潜在化合物。进一步评估这些化合物发现了一组基于磺酰叠氮模板的、有前景的清除剂。这些清除剂在体外和体内实验中的效率得到了证实。


引言


作为一种重要的信号分子，哺乳动物中H₂S的产生归因于包括胱硫醚β-合酶（CBS）、胱硫醚γ-裂解酶（CSE）、3-巯基丙酮酸硫转移酶（3MST）和半胱氨酰tRNA合成酶（CARS）在内的酶。虽然这些酶产生的信号分子的实际化学本质仍存在争议（H₂S与其密切相关的硫物种），但为了本文的目的，我们将讨论重点放在H₂S上。当前知识表明，失调的H₂S水平与许多病理过程相关，包括癌症、炎症和高血压。因此，能够精确调节H₂S浓度（上调和下调）的化合物既是重要的研究工具，也是潜在的治疗剂。在这方面，H₂S释放化合物（或供体）的研究最近引起了相当大的关注。已经开发了大量具有不同结构（硫代磷酸酯、N-巯基衍生物、硫代氨基甲酸酯、酰基二硫化物、硫代酰胺、偕二硫醇等）的供体，以及多种触发机制（硫醇触发、光触发、pH触发、ROS触发或酶触发）。这些分子的可用性增进了我们对H₂S在生物学中作用的理解。


另一方面，H₂S的过度产生在病理状态下也会导致不良影响，如脑缺血、癌症和糖尿病。因此，探索降低内源性H₂S含量的化学方法很重要；然而，这方面的研究远未充分发展。为此，一个明显的方法是探索H₂S生成酶的抑制剂。尽管这方面已做了一些努力，但目前可用的抑制剂仍远非理想。这些抑制剂（氨基氧乙酸、丙炔基甘氨酸、β-氰基-L-丙氨酸、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、胱硫醚类似物等）已知存在局限性，包括生物利用度差、特异性低和效力中等。由于H₂S生成酶普遍参与硫代谢，干扰酶活性可能导致不必要的副作用，这是抑制剂的普遍问题。H₂S研究的另一个重大挑战是H₂S始终与其密切相关的硫物种（包括H₂Sₙ和过硫化物）处于平衡状态。这进一步使降低内源性H₂S的任务复杂化。还已证明，包括CARS和3MST在内的酶主要产生半胱氨酸过硫化物或H₂Sₙ，H₂S是其随后的代谢产物。因此，仅通过抑制酶来控制内源性H₂S水平极其困难，如果不是不可能的话。


我们设想，降低内源性H₂S的另一种方法是开发清除剂。理想情况下，清除剂应特异性且快速地与H₂S反应，因此仅在特定生物系统中消除H₂S功能。通过这样做，可以避免干扰与H₂S无关的其他必要酶活性。这种方法的另一个优点是清除剂可以与特异性靶向分子偶联并递送到特定细胞位置，从而实现靶向清除。这提供了一种解释某些系统中H₂S消除结果的便捷方式。虽然这听起来是一个简单的想法，但据我们所知，H₂S清除剂尚未为上述目的进行探索。这种"化学敲低"概念是化学生物学的一个有趣方向，因为能够特异性去除生物重要分子的化学试剂应该具有广泛的应用。例如，醌甲基化物已被用作谷胱甘肽的清除剂，但其特异性仍然存在问题。


应该指出的是，H₂S清除剂在工业环境中是众所周知的，因为工业过程中H₂S的去除已被广泛研究。金属氧化物、烷醇胺和金属羧酸盐/螯合物等材料已被用作H₂S清除剂，显然这些不能应用于我们的生物系统。此外，几种化合物在临床上被用作H₂S中毒的解毒剂，但其特异性和在H₂S相关病理中的应用尚未被研究。例如，羟钴胺（HC）已被研究作为H₂S中毒的解毒剂，但它也能清除氰化物、NO、CO和ROS，表明其非特异性。


考虑到这些因素，我们开始探索强效H₂S清除剂。理想清除剂的标准是：1）对H₂S高度反应性（应在几分钟内而非几小时内与H₂S快速反应），2）对H₂S高度选择性（应仅与H₂S反应，不与ROS或RNS等其他物种反应），3）可忽略的生物活性（清除剂及其H₂S反应产物应无或低生物活性），以及4）结构修饰的灵活性（例如，引入靶向分子）。在我们看来，这些标准与H₂S荧光传感器的标准相同，这是一个研究充分的领域。我们最近构建了一个关于H₂S荧光传感器的在线数据库。它涵盖了所有已报道的传感器及其关键参数（包括结构、溶解度、细胞毒性、响应速率、激发/发射波长和选择性）。我们相信有效清除剂的最关键参数是它们对H₂S的反应性，这取决于反应位点。因此，我们分析了传感器完成反应所需的时间，并根据其反应位点对它们进行了分组。图1显示了8种主要类型的结果（每组包含5个以上传感器）：1）苯并噁二唑基传感器，2）芳基-硝基基传感器，3）芳基-叠氮基传感器，4）2,4-二硝基苯基传感器，5）醛基传感器，6）二硫化物基传感器，7）磺酰叠氮基传感器，和8）吲哚鎓基传感器。这些类型中代表性传感器的结构如支持信息中的图S1所示。应该指出的是，我们没有包括金属硫化物沉淀基传感器，因为我们不期望这种反应适合清除剂，因为金属化合物的固有毒性。


从图1可以看出，1-3型传感器显示出相对较长的反应时间（约60分钟），而5-8型传感器显示出快得多的响应（不到10分钟）。基于这一分析，选择了30种化合物（图2）。除了快速反应速率外，还考虑了以下标准：a）对H₂S与生物硫醇的高报道选择性（大于100倍），以及b）传感器之前在细胞中的使用，表明低毒性。我们还试图涵盖结构多样性，因此即使某些代表性传感器的响应速率或选择性不那么高，也包括了一些代表性传感器模板。此外，还包括了代表杂项传感器（9-11型，每组少于4个已报道传感器）的选定结构。更重要的是，由于我们的目标是识别去除H₂S的分子，荧光组分是不必要的。因此，对于某些传感器，仅使用了它们的H₂S反应模板。值得注意的是，已报道传感器的性质之前已在不同条件下测定，有时甚至在高浓度有机溶剂中。为了系统地比较这些传感器衍生的清除剂，候选物在纯缓冲液中评估其功效。

图1. 已报道H₂S传感器的响应时间。传感器分为8种类型。响应时间被分析并以均值±标准误呈现。

图2. 清除剂候选物的结构（1型（SS1,2）、2型（SS3,4）、3型（SS5-8）、4型（SS9）、5型（SS10）、6型（SS11-14）、7型（SS15-21）、8型（SS22-24）、9型（SS25,26）、10型（SS27-29）和11型（SS30））。


这些化合物的清除能力通过以下方案评估：H₂S溶液（100 mM）在PBS中新鲜制备并置于密封小瓶中。H₂S浓度通过Unisense H₂S微传感器连续监测。如支持信息中的图S2a所示，如果不添加清除剂，则维持稳定的H₂S浓度。当添加100 mM CuSO₄时，观察到浓度急剧下降（支持信息，图S2b），作为阳性对照证明该方法可以监测H₂S浓度变化。使用有效清除剂时，观察到H₂S浓度快速下降（图3a），而使用无效清除剂时，观察到缓慢或有时可忽略的H₂S浓度下降（图3b）。为了比较清除剂的效率，记录了T₁/₂（浓度降至50%所需的时间），并在支持信息中的图S3中进行了总结。如果T₁/₂ > 5分钟，则认为清除剂无效。对于有效清除剂（T₁/₂ < 5分钟），我们还测试了500 mM半胱氨酸的干扰。这是因为H₂S反应位点可能与生物硫醇反应，尽管速率较慢。我们想确保清除剂不会被硫醇消耗。如支持信息中的图S3所示，从30个候选物中，我们发现了11种有前景的清除剂（SS2-3、SS10、SS13、SS15-20和SS22），它们可以快速去除H₂S，且其清除能力不受半胱氨酸的显著影响。这一高成功率表明H₂S传感器数据库是清除剂识别的有用起点。

图3. 代表性H₂S清除曲线。a）快速清除剂SS16（100 mM）和b）慢速清除剂SS5（100 mM）被加入H₂S溶液中。50 mM处的灰色虚线显示T₁/₂值。


为了进一步验证这些有前景的分子，我们在更复杂的环境中测试了它们的H₂S清除能力。简而言之，在含有10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中制备了200 mM H₂S溶液，并用清除剂（200 mM）处理。孵育1小时后，通过H₂S气体捕获结合亚甲蓝测定法测量剩余的H₂S。如图4所示，SS15-20和SS22有效降低了H₂S含量，而SS2、SS3、SS10和SS13的清除能力有所降低。培养基中的其他氨基酸或蛋白质可能与H₂S竞争与这些清除剂反应，从而降低其功效。

图4. 用亚甲蓝测定法测量捕获的H₂S。在含有10% FBS的细胞培养基中，H₂S（200 mM）在20 mL小瓶中处理，小瓶内放置气体捕获Eppendorf管。Con = 对照（无清除剂）。


随着这些化合物（SS15-20、SS22）被鉴定为可能的清除剂，我们在几种细胞系（包括HeLa和SNU398）中测试了它们的毒性。由于这些结构基于已在细胞中使用的已知传感器，我们不期望看到显著的毒性。在我们的研究中，磺酰叠氮（SS15-20）显示出可忽略的毒性，但发现SS22具有毒性（支持信息，图S5）。因此，磺酰叠氮被鉴定为最有前景的清除剂。