缺血性卒中再灌注后亟需安全高效的细胞保护策略，而现有药物治疗仍未满足这一临床需求。纳米技术为改善脑内药物递送提供了新思路，但纳米材料穿透血脑屏障的效率十分有限，且长期颅内滞留可能诱发神经毒性。本研究利用氢气（H₂）的抗炎、可穿透血脑屏障及高生物安全性等优势，通过P-选择素结合肽修饰硅化锆（ZrSi₂）纳米颗粒，构建了炎症血管靶向/锚定型产氢系统（ZSNP），模拟P-选择素/P-选择素糖蛋白配体介导的固有免疫募集过程。

图2、 ZSNP释放的氢分子穿越血脑屏障并发挥免疫调节作用：A为氢分子在3D间充质干细胞（MSC）球体中的时间依赖性渗透结果，ZSNP仅富集于球体表面，而释放的氢分子可快速进入球体核心，氢探针荧光强度随时间升高；B为体外微流控芯片BBB模型示意图，左通道共培养bEnd.3细胞和周细胞构建BBB，中间通道接种包埋于Matrigel的脑细胞和氢探针模拟脑实质，右通道提供培养所需培养基；C为微流控芯片细胞培养明场图；D为左通道VE-钙黏蛋白免疫染色，证实内皮细胞形成紧密连接，BBB模型构建成功；E为给药15 min后右通道脑细胞的氢信号共聚焦图，证实氢分子可快速穿透BBB；F为体外Transwell BBB模型示意图，上室为bEnd.3单层模拟BBB，下室为预孵育氢探针的小胶质细胞；


G、H分别为Transwell模型中氢渗透的代表性共聚焦图和定量分析结果，给药10 min后即可在下室检测到氢信号，且信号强度随时间升高，12 h时溶解氢浓度可达16.1 μM；I为Transwell共培养下室小胶质细胞的炎症相关标志物（活性氧ROS、诱导型一氧化氮合酶iNOS、精氨酸酶1 ARG1、磷酸化组蛋白H2A.X γH2A.X）共聚焦图，J为对应定量结果，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激诱导小胶质细胞促炎活化，ZSNP提取物效果有限，而ZSNP凭借产氢能力效果优于临床对照药依达拉奉：清除ROS能力提升2.3倍，iNOS和γH2A.X表达分别降低1.3倍和1.6倍，ARG1水平较依达拉奉升高2.4倍，仅ZSNP可将小胶质细胞状态恢复至接近对照组水平。

图3、ZSNP减轻缺血性卒中后的脑组织坏死并缓解神经炎症激活。A为实验设计示意图，依达拉奉（1 μg/g体重，每日一次）和ZSNP（10 μg/g体重，每两日一次）在14天内经静脉给药；B、C分别为给药3天后tMCAO小鼠卒中区域的伊文思蓝外渗代表性图像和定量结果，磷酸盐缓冲液（PBS）组可见明显血管渗漏，ZSNP组渗漏少于PBS组，略优于依达拉奉组；D、E分别为给药3天后2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色脑切片代表性图像和相对梗死面积定量结果，绿色虚线标注梗死区域，ZSNP较PBS组显著减少组织坏死，疗效略优于依达拉奉；F、G分别为激光多普勒扫描代表性图像和血流灌注百分比定量结果，PBS组缺血半球灌注持续下降，ZSNP组较PBS组显著改善颅内灌注，第3、7天略优于依达拉奉；


H为给药14天后梗死及周围区域的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞和葡萄糖转运蛋白1（Glut-1）阳性血管免疫荧光图，白色星号标注梗死区域；I为Glut-1阳性面积定量结果，ZSNP较PBS组显著减少星形胶质细胞增生，同时增加梗死核心和缺血半暗带的Glut-1+新生血管密度，梗死核心Glut-1+微血管密度较依达拉奉组高4.2倍；J为给药7天后缺血及周围区域离子钙结合适配器分子1（Iba-1）阳性小胶质细胞免疫染色图；K、L分别为Iba-1+小胶质细胞的表面积体积定量和缺血半暗带小胶质细胞相对面积定量结果，PBS组小胶质细胞呈活化的阿米巴样形态，表面积和体积增大，ZSNP和依达拉奉均可诱导小胶质细胞向静息的分枝状形态转变，ZSNP的诱导效果更显著，且ZSNP可显著减少小胶质细胞在缺血半暗带的聚集，依达拉奉仅呈边际减少；M为卒中后7天缺血半球的炎性细胞因子水平，ZSNP较PBS组显著降低促炎细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-2、TNF-α）水平，同时上调抗炎细胞因子IL-4水平，效果与依达拉奉相当。

图4、ZSNP对缺血性脑修复的促进作用依赖于小胶质细胞：A为实验设计示意图，通过集落刺激因子1受体拮抗剂PLX5622饲料耗竭小胶质细胞验证其功能必要性；B、C分别为小胶质细胞耗竭后的TTC染色脑切片代表性图像和梗死面积定量结果，小胶质细胞耗竭后ZSNP的治疗效果被严重削弱，脑坏死组织广泛存在；D、E分别为Glut-1+血管的免疫染色图和定量结果，小胶质细胞耗竭阻碍了ZSNP诱导的Glut-1+血管向内生长；F、G分别为200 kDa神经丝蛋白（NF200）阳性轴突的免疫染色图和定量结果，小胶质细胞耗竭抑制了ZSNP诱导的轴突萌发；H为卒中后7天分离的小胶质细胞5'端RNA模板转换机制测序（SMART-seq）主成分分析，ZSNP组与依达拉奉组、PBS组的转录谱存在显著差异；


I为差异表达基因的基因本体（GO）富集分析，ZSNP组小胶质细胞中血管生成、伤口愈合、脑发育等生物学过程显著富集；J为基因集富集分析（GSEA），ZSNP组血管生成、轴突发生、神经元分化、伤口愈合等通路呈正向富集，炎症反应通路呈负向富集；K、L分别为促炎基因（Pld3、Ccl5等）和修复相关基因（Wnt5a、Vegfa等）的表达热图，ZSNP组促炎基因下调，修复相关基因上调；M为Wnt通路相关基因表达验证，ZSNP可同时激活经典Wnt/β-连环蛋白和非经典Wnt/Ca²⁺通路；N为体外小胶质细胞-神经元共培养示意图，用于验证氢分子对小胶质细胞介导的神经元功能调控作用；后续分子对接显示氢分子与CaMKIIγ、Wnt5a仅存在弱非特异性结合，提示其通过抗氧化和免疫调节作用间接调控通路，而非直接结合靶点。

图5、ZSNP诱导神经发生与轴突生成：A、B分别为给药14天后皮质区双皮质素（Dcx）和Ki67共染的免疫荧光图和增殖性神经母细胞定量结果，ZSNP组皮质区Ki67+/Dcx+增殖性神经母细胞数量较PBS和依达拉奉组显著升高；C、D分别为海马区Dcx+神经母细胞的免疫荧光图和迁移距离定量结果，ZSNP组神经母细胞向缺血皮质的迁移距离较依达拉奉组长约2.3倍；E、F、G分别为给药14天后梗死及周围区域NF200+轴突的免疫荧光图、缺血半暗带轴突密度定量和梗死区轴突穿透深度定量结果，ZSNP组缺血半暗带轴突密度升高，且梗死区内NF200+轴突的丰度和穿透深度显著高于PBS和依达拉奉组；


H、I分别为给药12周后的苏木精-伊红（H&E）染色和尼氏染色结果，PBS组梗死区存在广泛坏死和组织降解，依达拉奉较PBS减少坏死但修复效果弱于ZSNP，ZSNP组梗死区结构完整的神经元得以保留；L、M、N分别为12周时神经丝面积的免疫荧光图、梗死区神经丝面积定量和轴突向梗死区浸润深度定量结果，ZSNP组12周时的神经丝丰度和穿透深度显著高于其他组，优于14天时的效果；O为12周时血管（Glut-1）和神经丝（βIII微管蛋白Tuj-1）的双标免疫荧光图，ZSNP组血管与轴突存在显著的空间相关性，血管密度和Tuj-1表达量显著升高；P为12周时神经血管单元标志物（周细胞标志物血小板衍生生长因子受体β PDGFR-β、星形胶质细胞终足标志物水通道蛋白4 Aqp-4）的免疫荧光图，ZSNP组血管被周细胞和星形胶质细胞终足成熟覆盖，神经血管单元结构恢复完整。


结论与展望


该设计无需依赖纳米颗粒穿透进入脑实质，而是让ZSNP锚定于血脑屏障的血管部位，通过水解反应在局部持续生成H₂。释放的H₂可穿越血脑屏障，通过抗氧化与免疫调节机制发挥细胞保护作用，协调多细胞修复进程。此外，ZSNP可促进小胶质细胞介导的血管生成与神经发生，引导轴突沿新生血管轨迹投射，并通过非经典Wnt/Ca²⁺通路增强小胶质细胞与神经元的互作。这种神经血管网络的重构可支持功能性神经环路的再整合，最终实现的结构与功能恢复效果优于临床常用药依达拉奉。该策略通过在血脑屏障界面持续释放H₂，无需纳米颗粒颅内蓄积，为缺血性卒中提供了一种前景广阔、临床负担更低的神经保护新方案。


Unisense 氢气电极在本论文中发挥了"原位、实时、连续"监测溶解 H₂的独特作用。体外确认 ZSNP 具备持续产 H₂ 能力且不因 P-肽修饰而受损，体内则直接证明锚定于缺血 BBB 血管的 ZSNP 能在卒中病灶局部维持稳定的 H₂ 浓度，从而为该"无需纳米颗粒入脑、于 BBB 界面持续释放 H₂"的神经保护策略提供了核心的实验证据。