研究简介：本研究以连续流厌氧/好氧/缺氧（AOA）系统处理实际低 C/N 生活污水（平均 C/N≈3.13）为对象，系统揭示了内源性反硝化过程的电子供体来源及其对氧化亚氮（N₂O）的削减能力。针对低 C/N 生活污水在碳源匮乏条件下难以兼顾高效脱氮与 N₂O 减排的行业难题，研究通过 60 天长周期反应器监测、批次实验、分层胞外聚合物（EPS）与游离氨基酸剖析、Michaelis-Menten 动力学拟合、¹⁵N 同位素示踪及功能基因转录分析等多手段耦合，阐明内源性反硝化的驱动机制与 N₂O 汇行为。研究结果表明，缺氧区内源反硝化由多重内源电子供体协同驱动。除已知的聚羟基脂肪酸酯（PHA）和糖原（Gly）外，松结合 EPS（LB-EPS）与胞内氨基酸库是关键补充供体，弥补了 PHA 与 Gly 单独计量无法解释的硝酸盐去除缺口。其中LB-EPS 的 COD 净消耗显著，谷氨酸、苏氨酸等氨基酸被优先利用。批次实验进一步证实，胞内碳源耗竭或 EPS 去除均导致内源反硝化速率骤降并引发 N₂O 积累，说明胞内碳储备与 EPS 结构完整性协同抑制 N₂O积累。


动力学与传质分析表明，缺氧区是高效的 N₂O 汇。N₂O 还原对硝酸盐还原具有动力学竞争优势，表观亲和常数 Km 低至 1.4–2.1 μM，且生物还原对 N₂O 去除的贡献随浓度升高可达 95.8%–99.9%，远超过物理吹脱。¹⁵N 同位素示踪揭示了外源 N₂O 被快速消耗、内源产生的标记 N₂O 经历"先升后降"的快速周转过程，证实净 N₂O 削减源于活跃的还原而非仅因生成量少，且外源 N₂O 的引入可进一步降低标记中间体的峰值积累。分子层面，nosZ 与 norB 基因在中后段缺氧区显著上调，N₂O 还原酶（NOS）活性位居还原酶前列，提示酶学调控与功能表达效率在维持强 N₂O 汇功能中起重要作用。本研究明确了 EPS 与氨基酸作为内源电子供体的重要贡献，揭示了 AOA 工艺缺氧区凭借高 N₂O 亲和力和富余还原能力实现 N₂O 高效削减的机制，为低 C/N 生活污水碳高效脱氮与温室气体协同减排提供了理论依据与工程参考。


Unisense微电极分析系统的应用


丹麦 Unisense 公司的微电极/微传感器类设备承担了溶解态 N₂O（dN₂O）与溶解氧（DO）的高分辨率、实时原位监测核心任务，是揭示内源性反硝化驱动机制与缺氧区 N₂O 汇能力的关键观测手段。反应器层面，一套完全封闭的连续流 AOA 系统（厌氧:好氧:缺氧体积比 1.5:2.5:4.0，HRT=14.4 h，SRT=30d）的反应器盖集成有 pH、DO 与 dN₂O 在线监测专用接口，其中 dN₂O 由一台原位在线 N₂O 分析仪（Unisense,Denmark）连续监测，为长期运行（60 d）沿厌氧/好氧/缺氧各区的氮素与 dN₂O 分布解析提供了连续数据基础。批次实验层面，所有 3.0 L 密封磁力搅拌缺氧批次反应器均通过专用端口插入一支经校准的 N₂O 与 DO微传感器，以 30 s 间隔实时、高分辨率同步记录 dN₂O 与 DO 动态浓度。    


实验结果


处理低C/N生活污水的连续流厌氧/好氧/缺氧（AOA）系统中，内源性反硝化由多类内源电子供体协同驱动：除已明确的胞内聚羟基烷酸酯（PHA）、糖原外，松散结合胞外聚合物（LB-EPS）与胞内氨基酸是补充电子供给、弥补PHA与糖原理论供能缺口的关键组分，且LB-EPS与胞内碳源的代谢协同是避免反硝化过程N₂O积累的核心保障，单独消耗胞内碳源或去除EPS均会导致N₂O显著累积。研究进一步证实系统缺氧区为高效N₂O汇，其反硝化群落对N₂O的表观亲和力极高，半饱和常数（Km）仅为1.4~2.1μM，远低于常规外源反硝化活性污泥与厌氧氨氧化系统，且N₂O还原最大比速率与NO₃⁻还原为N₂O的最大比速率比值达4.8，还原潜力远高于产生潜力；结合质量传递分析，0.5mg-N/L溶解N₂O浓度下生物还原贡献可达95.8%，浓度升高后贡献接近99.9%，物理吹脱作用可忽略。¹⁵N同位素示踪结果显示，外源投加的N₂O可被优先快速消耗，内源反硝化过程中产生的N₂O中间体周转速率极快，证实缺氧区可同步清除原位产生的N₂O及上游硝化过程输入的N₂O。分子层面分析表明，缺氧区中段至末端的nosZ（编码N₂O还原酶）、norB（编码一氧化氮还原酶）基因显著上调，N₂O还原酶相对活性达96.52U/g蛋白，仅次于硝酸盐还原酶，尽管nosZ与nirS+nirK的转录丰度比值小于1，但酶水平的调控与功能表达效率保障了高效N₂O还原，并非依赖N₂O还原菌的高丰度。工艺运行效果显示，该AOA系统在进水C/N均值3.13的条件下，总氮去除率达81.84%，出水总氮稳定在10.69mg-N/L，缺氧区溶解N₂O浓度长期低于0.01mg-N/L，气态N₂O排放极低，实现了碳高效脱氮与N₂O减排的协同，为低C/N污水处理的低碳化升级提供了机制支撑。。

图 1、连续流厌氧/好氧/缺氧（AOA）系统运行性能及污染物沿程归趋：(a) 系统长期运行污染物去除效果；(b) 污染物沿反应器纵向的转化特征；(c) 稳定运行期内内源性反硝化速率（EDNR）的变化规律；(d) 不同反应区氧化亚氮（N₂O）的时空归趋。误差线代表标准偏差（n=10）。其中好氧区为N₂O排放热点，气态N₂O（gN₂O）排放速率为2.10~3.77 mg-N/d，而缺氧区溶解态N₂O（dN₂O）浓度长期低于0.01 mg-N/L，仅存在微量气态排放。

图2、内源性反硝化的电子供体驱动特征：(a) 胞内碳储存聚合物（聚羟基烷酸酯PHA、糖原Gly）沿反应器的转化规律；(b-d) 溶解性胞外聚合物（S-EPS）、松散结合胞外聚合物（LB-EPS）、紧密结合胞外聚合物（TB-EPS）组分COD的分层分布特征；(e) 不同EPS组分及胞内游离氨基酸的代谢谱。

图3、关键内源电子供体对内源性反硝化及N₂O积累的影响：(a-c) 24h强化曝气耗尽胞内碳源后的污泥性能；(d-f) 超声预处理去除EPS后的污泥性能。(a)(d) 硝酸盐（NO₃⁻）还原曲线；(b)(e) 溶解氧（DO）消耗曲线；(c)(f) dN₂O动态变化。

图4、内源性反硝化群落的竞争动力学及N₂O还原能力：(a-c) 缺氧条件下NO₃⁻与N₂O的电子受体竞争特征；(d-f) 缺氧污泥N₂O还原的米氏（Michaelis-Menten）动力学拟合结果。(a)(d) 初始底物浓度与还原速率的关系；(b)(e) NO₃⁻消耗曲线；(c)(f) dN₂O动态变化。

图5、内源性反硝化过程中N₂O产消的¹⁵N同位素示踪结果：(a) 同时投加¹⁵N标记NO₃⁻与未标记⁴⁴N₂O的实验组（Group 1）中N₂O同位素异构体（⁴⁴N₂O、⁴⁵N₂O、⁴⁶N₂O）与N₂同位素异构体（²⁹N₂、³⁰N₂）的动态变化；(b) 仅投加¹⁵N标记NO₃⁻的对照组（Group 2）的对应动态变化。


结论与展望


在低C/N条件下实现高效脱氮的同时削减氧化亚氮（N₂O）排放，是可持续污水处理领域面临的核心挑战。尽管厌氧/好氧/缺氧（AOA）工艺脱氮性能优异，但支撑其内源性反硝化的电子供体来源，以及该过程固有的N₂O汇能力尚不明确。本研究以处理生活污水的连续流AOA系统为研究对象，系统运行参数为：污泥龄（SRT）30 d，混合液悬浮固体浓度（MLSS）3000~5000 mg/L，水力停留时间（HRT）14.4 h，好氧区溶解氧（DO）1~2 mg/L。


结果表明，内源性反硝化由胞内储存聚合物、游离氨基酸、胞外聚合物（EPS）等多类内源电子供体共同驱动，可保障系统稳定脱氮并有效抑制N₂O积累。耦合动力学与传质分析证实，缺氧区是高效的N₂O汇，其特征表现为对N₂O表观亲和力高、还原潜力显著高于产生潜力，且生物消耗作用远强于物理吹脱作用。¹⁵N同位素示踪进一步揭示，内源性反硝化过程中N₂O周转速率快，可被快速消耗。分子层面分析表明，该高N₂O汇活性与酶水平的调控密切相关。本研究填补了内源性反硝化过程中电子供体来源、N₂O产消机制的研究空白。 


Unisense 公司的微电极/微传感器类设备承担了溶解态 N₂O（dN₂O）与溶解氧（DO） 的高分辨率、实时原位监测核心任务，是揭示内源性反硝化驱动机制与缺氧区 N₂O 汇能力的关键观测手段。Unisense 设备以"反应器在线分析仪 + 批次微传感器"两种形态贯穿全程，把内源性反硝化的电子流分配、 N₂O 产–消平衡与动力学参数转化为可量化、高时间分辨率的数据链，直接支撑了"缺氧区是高效 N₂O 汇"这一核心结论的得出。