3.2.3 扰乱的氧化还原代谢和信号传导暗示芽萌发早期氧化还原活性增加


氧化还原代谢和信号传导也被暗示在植物发育中缺氧、代谢、激素和细胞周期调控通路的串扰或直接调控中。引言中强调的几项研究证明了氢过氧化物以及许多经典抗氧化酶在胁迫诱导的芽休眠或静止解除期间的诱导。在我们的数据中，通过两个醛脱氢酶、许多过氧化物酶（包括三个抗坏血酸过氧化物酶）和许多硫氧还蛋白样同源物表达升高，暗示了前 3 小时细胞氧化的增加，并在 24 小时进一步增加。然而，硫氧还蛋白 h 的同源物（先前显示在葡萄芽中被氰胺诱导）以及三个谷氧还蛋白同源物相对于 0 小时被抑制。编码过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶或抗坏血酸-谷胱甘肽循环和其他相关可溶性抗氧化剂的其他酶的转录本，其中一些先前已被证明在胁迫诱导的芽休眠或静止解除中转录响应，没有差异调控。综合来看，这些数据表明氧化还原稳态和信号传导是葡萄芽萌发的重要发育特征；然而，一些特定的氧化还原酶，如过氧化氢酶和硫氧还蛋白 h，可能对特定胁迫条件（如氰胺）更敏感，在先前的研究中一致显示它们的转录诱导。与糖酵解、发酵和其他缺氧相关代谢和信号传导过程的激活相比，氧化还原稳态的转录调控在芽萌发的前 3 小时后变得更加明显，表明缺氧诱导的信号传导先于氧化还原的实质性发展。


3.2.4 转录因子和顺式调控元件表明胁迫响应和分生组织特性重建先于芽萌发期间的有丝分裂


几个转录因子家族在前 24 小时富集，包括 3 小时的 AP2/EREBP、TCP（TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF1）和 GASA 家族转录因子，以及 24 小时的 MYB 和 B 型 ARR（拟南芥响应调控因子）转录因子（图 2）。为了进一步了解芽萌发期间的主要转录控制，我们对 DEG 的 2.5 kb 上游区域进行了已知顺式调控基序的富集分析。我们将重点放在前 24 小时（3/0 小时和 24/3 小时）的黑暗中。几个基序在前两个过渡中共同富集，如 E-box 和三个 bZIP 基序（bZIP16、bZIP68 和 AREB；图 3a；）。这些结合基序的普遍存在是可以理解的：E-box 基序最著名的是在建立昼夜节律中的作用；AREB 基序已知在脱水胁迫中发挥作用，而 bZIP16 和 bZIP68 结合基序参与光形态发生期间基因表达的氧化还原依赖性调控。同样令人感兴趣的是，虽然富集程度较低，但 ELONGATED HYPOCOTYL（HY5）和 PHYTOCHROME-INTERACTING FACTORs（PIF）的结合基序，再次突出了自养发育的组成型激活（表 S5）。

图3. 在持续黑暗（D）中3/0和24/3小时发育比较的DEG（FDR P ≤ 0.01，FC|2.5|）启动子区域中鉴定的已知顺式调控结合基序的富集分析。(a) 柱状图显示比较的10个最显著富集基序（最低P值），3/0小时（左上角）和24/3小时（左下角）。(b) 维恩图区分3/0和24/3小时比较中的共同和独特基序。散点图列出每个比较中发现的独特基序。


特定的结合基序以阶段特异性方式富集（图 3b）。在 3 小时，BCP1（BASIC PENTACYSTEINE1）、FAR1（FAR-RED IMPAIRED RESPONSIVE）和 CAMTA1（钙调蛋白结合转录激活因子 1）结合基序高度富集，以及几个 MYB 和 AP2/EREBP 基序。BCP1 和 FAR1 样转录因子都被暗示参与许多分生组织和发育功能，汇聚于 SHOOT MERISTEMLESS，这是茎尖分生组织中分生组织特性和细胞周期基因的重要调控因子。CAMTA1 基序的富集可能是此阶段温度转变的产物，尽管钙信号传导和响应是 3 小时高度调控的转录本之一（表 S4），并且先前被暗示参与葡萄芽休眠解除。


在 24 小时，独特富集的结合基序较少，约为 3 小时发现数量的一半；然而，三个 MYB3R 基序显著富集。植物仅拥有少量三 Myb 重复蛋白（MYB3R），拟南芥中的许多已被证明直接调控经典有丝分裂蛋白。敲除和生化研究表明，拟南芥 MYBR1 和 MYB3R4 作为 G2/M 期基因的转录激活因子，而 MYBR3 和 MYB3R5 作为抑制因子，可能发挥促进内复制和分化的功能。在我们的数据中，MYB3R1、MYB3R4 和 MYB3R5 的结合基序富集。这可能与 24 小时 A 型和 B 型细胞周期蛋白和 CDK 表达升高相关，如前所述。24 小时特别富集的其他感兴趣基序包括 WUSCHEL1 基序。WUSCHEL1 代表在分生组织中表达的一类保守的同源异型转录因子家族，对于约束干细胞生态位特别重要，与其他位置线索一起，包括根尖分生组织中的 PLETHORA1（PLT1）。综合来看，这些数据表明，主要是胁迫/刺激的转录响应和分生组织特性的重建先于芽萌发期间的有丝分裂恢复。虽然编码 DNA 复制许可的基因在 3 小时表达升高，但 24 小时大量 A 型和 B 型细胞周期蛋白和 CDK 的升高支持了这一结论，特别是关于有丝分裂。


3.2.5 保守的缺氧响应基因和 HRPE 的代表性表明氧气依赖性信号传导在芽萌发期间很重要


先前的研究已鉴定出一组在门之间保守的缺氧响应基因，在拟南芥中对应 49 个。此外，最近鉴定了一个独特的植物 HRPE，并显示在氧气依赖性信号传导中发挥作用。我们使用 BLAST 鉴定了 49 个拟南芥缺氧响应基因的 122 个葡萄同源物集，并使用现有的 FC 和 FDR 标准查询我们转录数据的表达谱。122 个葡萄同源物中的 44 个（36%）在前 24 小时差异表达（图 4，上面板）。其中超过一半在 3 小时升高，许多在 24 小时（相对于 3 小时）没有变化或仅适度抑制。

图4. 在持续黑暗（D）中芽萌发前24小时DEG（FDR P ≤ 0.01，FC|2.5|）中推定葡萄缺氧响应基因的差异表达。拟南芥保守缺氧响应基因的同源物显示在热图的上部面板（紧邻黄色列）。在2.5 kb上游启动子区域（参见方法）中含有一个或多个缺氧响应启动子元件（HRPE）的DEG显示在热图的下部面板（紧邻绿色列）。在葡萄参考基因组中有197个基因含有一个或多个HRPE。标有星号的基因是含有一个或多个HRPE基序的拟南芥缺氧响应基因同源物。标有黑框（■）的基因是拟南芥第七组乙烯响应因子（ERF-VII）HRE2（也称ERF071）的同源物。


3 小时升高的许多转录本已经描述过，特别是关于糖酵解、发酵和缺氧，包括 HRE2，但值得注意的是还有四个植物半胱氨酸氧化酶的同源物，它们在 ERF-VII 上游发挥作用。HRPE 是一个特定且最近定义的植物顺式调控基序，不存在于 Homer 使用的数据库中。我们在葡萄基因组中鉴定了 252 个在上游启动子区域拥有一个或多个 HRPE 的基因。其中，55 个存在于 4022 个 DEG 的总核心集中，其中 47 个在前 24 小时差异表达，即几乎占整个含 HRPE 转录组的 20%（图 4）。这包括 44 个保守缺氧响应基因葡萄同源物中的 9 个（在图 4 下面板中未重复）。此外，许多在 3 小时差异调控的含 HRPE 基因在 24 小时没有进一步变化。虽然需要谨慎解释，但这些数据表明氧气依赖性信号传导在芽萌发恢复生长的前 3 小时内最重要；然而，这些基因没有明显的抑制，表明缺氧依赖性基因表达可能在前 24 小时维持。这与芽中低氧状态在前 24 小时持续，随后氧化一致。诱导的 GASA 样转录本之一中存在 HRPE 特别有趣，鉴于这些转录因子在已呈现数据中的突出地位，以及拟南芥中该家族几个成员的氧化还原调控。因此，GASA 样转录因子可能提供 GA-、氧气-和氧化还原依赖性之间的重要汇聚点。