3.2.1 芽萌发的阶段特异性转录调控


阶段特异性 DEG 的维恩图显示，连续阶段之间共同调控的转录本很少（图 2a）。在 3/0 小时过渡中上调的 996 个转录本中，只有 13 个在 24/3 小时进一步上调。事实上，即使放宽 FC 标准以考虑在 24/3 小时未显著下调的基因（即 FC ≥ -2.5），这个数字仍然是 13（表 S4）。其中包括丝氨酸羧肽酶、组蛋白 H4 和 GASA 样蛋白（赤霉酸刺激拟南芥）的同源物。这些转录本代表了 3/0 小时过渡中主要调控的功能类别（图 2a），特别是蛋白质合成、折叠和转运的强烈特征，以及细胞周期、糖酵解和发酵、钙和赤霉酸（GA）信号传导的调控。只有两个转录本在最初两个阶段之间共同被抑制，一个是 GA3-β-羟化酶，编码催化 GA4 合成的酶，该酶受 GA 的反馈抑制。

图2. 在持续黑暗（D）中发育比较3/0、24/3、72/24和144/72小时的差异表达基因（DEG）的维恩图和功能富集分析。(a) 维恩图显示DEG（错误发现率[FDR] P ≤ 0.01）的分布，分类为上调（倍数变化[FC] ≥ 2.5，紫色）和下调（FC ≤ -2.5，绿色）。(b-d) 柱状图总结发育比较(b) 3/0小时、(c) 24/3小时和(d) 72/24小时中显著富集的功能类别（FDR P ≤ 0.01，Fisher精确检验）；在144/72小时数据中没有发现富集的类别。对每个比较进行三种不同的功能富集分析，其中"All"（上调加下调基因，灰色）、"Up"（上调基因，紫色）和"Down"（下调基因，绿色）指评估的基因列表。

观察 3/0 小时过渡中特异性上调的转录本，细胞周期的恢复是明显的。特别是组蛋白 H3、细胞周期蛋白 D（CYCD）、细胞分裂周期 20（CDC20）、CDC7 和增殖细胞核抗原（PCNA）的同源物。CYCD 和 PCNA 急性参与复制许可，并已在豌豆和拟南芥中显示功能相互作用。分生组织功能也由两个 MADS 盒 AGL24 同源物以及春化不敏感 3（VIN3）的强烈诱导所暗示，下文进一步描述。几种生长素响应转录本也在 3 小时独特上调，包括两个 SMALL AUXIN UP RNA（SAUR）同源物、一个生长素结合蛋白（ABP）和生长素响应因子（ARF）。在 3 小时特异性抑制的基因包括几个与细胞周期或生长停滞相关的转录本，如两个 KIP 相关细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂同源物、DOG1（萌发延迟 1）和 BAK1（油菜素内酯不敏感 1 相关受体激酶 1）。在 3 小时特异性诱导但在 24 小时抑制的转录本包括 CDC6、CDT1A 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶和两个额外的 GASA 同源物。拟南芥 CDC6 和 CDT1A 被报道为 G1/S 期基因的 E2F 转录激活因子的靶标，直接参与 DNA 复制许可。GASA 蛋白被广泛报道为 GA 信号传导的靶标，发挥发育和分生组织相关功能，其中几个已被证明受氧化还原调控。在芽萌发诱导后立即且在没有光照的情况下，GA 信号传导的普遍特征是显著的，鉴于 GA 是蔷薇属植物芽生长光控制的中心。


缺氧响应 2（HRE2，也称 ERF071）和两个乙醇脱氢酶（ADH）同源物也以这种方式特异性调控，下文进一步详细描述。


许多共同通路在随后的 24/3 小时过渡中被暗示，包括代表 GA 和生长素相关通路。细胞周期调控也在上调转录本中富集；然而，这里特别表达的是有丝分裂基因，如编码 A 型和 B 型细胞周期蛋白和 CDK 的基因（三个 CYCB、三个 CDKB、三个 CYCA、一个 CDC20、一个 WEE1 蛋白激酶和一个二聚化伴侣（DP）样 DEL1 的转录本升高）。此过渡中其他独特上调的基因包括与分生组织功能相关的转录本，例如 MADS 盒 SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）和 BRUSHY1（BRU1）、CONSTANS 样同源物（COL16）以及大量编码光合系统组分、光捕获复合物和其他参与叶绿体生物发生的调控蛋白的基因，下文进一步讨论。


最后两个过渡之间差异调控的基因包括与早期阶段的一些共同通路，例如生长素和 GA 响应转录本以及组蛋白在 72/24 小时过渡上调，而独特调控的转录本主要与初级代谢相关，下文讨论。


3.2.2 糖酵解、发酵和缺氧响应转录本在芽萌发早期升高


更具体地关注氧气依赖性信号传导和代谢所涉及通路的转录调控，与底物水平磷酸化和发酵相关的转录本在 3 小时上调（例如，α-淀粉酶、三个蔗糖合酶、一个液泡转化酶、三个磷酸果糖激酶、两个甘油醛-3-磷酸脱氢酶、一个丙酮酸激酶、三个 ADH 和两个丙酮酸脱羧酶转录本）。其中许多已被鉴定为缺氧诱导代谢的标志，以及休眠或静止解除期间胁迫诱导代谢的标志。到 24 小时，糖酵解转录本保持较高表达水平；然而，参与发酵的转录本相对于 3 小时大幅降低。也许令人惊讶的是，编码 GABA 支路中心酶的谷氨酸脱羧酶在 24 小时被抑制，在 3 小时没有变化。由于 GABA 支路是缺氧诱导代谢和芽休眠解除的共同特征，该通路可能已在 0 小时启动，因此在 3 小时没有变化，然后在 24 小时被抑制。然而，24 小时对额外底物以推动代谢的需求由糖异生组分（例如，果糖 1,6-二磷酸酶和 NADP 依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶）表达升高所暗示。尽管在最后两个过渡中代谢的转录调控没有明确方向，但有证据表明编码糖酵解和发酵功能的转录本被调控。


上述 HRE2 的差异调控与本研究的目标特别相关。拟南芥 HRE2 是 O₂/NO 依赖性 N-末端规则蛋白水解的 ERF-VII 底物之一，也是已知转录响应缺氧的两个之一。此外，在 3 小时特异性强烈上调了一个缺氧响应同源物和两个缺氧上调 1 HSP70，进一步表明芽萌发早期缺氧状态的发展。上述 VIN3 也被证明是缺氧适应所必需的，正如它对冬性一年生植物春化响应的作用一样。引人注目的是，到 24 小时，两个蔗糖非发酵 1 相关激酶 1（SnRK1）催化亚基 AKIN gamma 的同源物表达升高，这与先前在葡萄芽休眠解除期间鉴定的 SnRK1 同源物一致。SnRK1 是能量稳态的主要枢纽，并显示在缺氧条件下被诱导，作为 α-淀粉酶基因启动子区域中糖响应元件的正调控因子，使底物供应给糖酵解和发酵。此外，在我们的数据中，四个 CIPK（CBL 相互作用蛋白激酶）基因的同源物在 3 和/或 24 小时被诱导，这些基因正调控植物中 SnRK1 介导的饥饿响应。这也与 GA 信号传导的强烈证据相容，GA 也可以促进淀粉酶表达。相比之下，海藻糖-6-磷酸丰度的调控没有明确方向，海藻糖-6-磷酸是能量稳态和信号传导中 SnRK1 的主要对应物，因为编码海藻糖-6-磷酸合成和分解的基因在此期间差异调控。


植物激素乙烯已被广泛暗示参与缺氧适应。许多乙烯合成和信号传导基因的同源物在前 24 小时差异调控，包括一个 ACC 合酶、五个 ACC 氧化酶转录本和两个乙烯过量产生 1（ETO1）的同源物，ETO1 编码 ACC 合酶的负调控因子（表 S4）。此外，许多 AP2/EREBP（APETALA2/乙烯响应元件结合蛋白）同源物被调控，下文进一步描述。虽然 ACC 合酶水平在 3 小时降低，但 ETO1 也降低，而三个 ACC 氧化酶转录本升高。这些转录本在 24 小时没有变化，表明表达水平维持，因此暗示芽萌发的前 24 小时乙烯合成升高。综合来看，这些数据为代谢控制的转录激活提供了强有力的证据，这是缺氧诱导的典型特征。