采样与测定


对于培养试验，在培养后第1、2、3、5、7、14、21、28、35、42、49、63和70天，随机采集9个位点的土壤样品，共20 g。对于田间试验，在小麦抽穗期和灌浆期施肥后第1、3、5和7天采集土壤样品（0–20 cm层）。在每个小区随机采集六个点的土壤样品并混合形成一个复合样品。土壤过2 mm筛，5.00 g新鲜土壤用2 M KCl提取，用流动注射分析仪测定NH₄⁺和NO₃⁻浓度。尿素-N用二乙酰一肟比色法测定。土壤含水量通过在105°C下烘箱干燥样品24小时后进行重量测定，以计算充水孔隙度。


第5天采集的土壤样品用于测定土壤酶活性。脲酶和三种反硝化酶（硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和羟胺还原酶）的活性用比色法测定。简要地说，脲酶活性通过将10 mL 10%尿素溶液与10 g土壤在100 mL烧杯中混合，然后在37°C下培养24小时来测定。在578 nm处用分光光度法测定铵的形成。酶活性表示为NH₄⁺-N毫克每克24小时。对于硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和羟胺还原酶的测定，分别将1 mL 1% KNO₃溶液、0.5% NaNO₂溶液和0.5% NH₂OH加入1.0 g风干土（过<1 mm筛）。这些混合物在30°C下培养24小时，测定还原的NO₃⁻、NO₂⁻和NH₂OH的量，分别代表硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和羟胺还原酶的活性。


各种进一步分析使用以下公式计算：


脲酶抑制率% = (A - B) / A × 100


其中A为无脲酶抑制剂的尿素水解含量（mg·kg⁻¹），B为有脲酶抑制剂的尿素水解含量（mg·kg⁻¹）。


表观硝化率% = NO₃⁻ / (NH₄⁺ + NO₃⁻) × 100


硝化抑制率% = (C - D) / C × 100


其中C为无硝化抑制剂3天内NO₃⁻含量的差值（mg·kg⁻¹），D为有硝化抑制剂3天内NO₃⁻含量的差值（mg·kg⁻¹）。


氮素回收率 = (NH₄⁺ + NO₃⁻ + 尿素-N) / 尿素 × 100


气体通量测定


在培养试验中，使用N₂O微传感器进行在线测量，连续数据记录（N₂O-100，检测限为0.0028 mg N₂O-N·L⁻¹）。每次批次测试前进行两点校准，用去离子水作为零点，N₂O储备溶液的溶解N₂O浓度为7.235 mg N·L⁻¹。已证明传感器信号在0–14 mg N₂O-N·L⁻¹范围内呈线性。


田间试验中的N₂O排放用密闭静态箱收集，包括顶部和中间腔室部分，每个尺寸为60 cm × 50 cm × 55 cm（长×宽×高），以适应生长植株的高度，最终有效高度达到110 cm。每个小区安装两个箱体，每个箱体的底座插入土壤10 cm深以防止空气泄漏，每个箱体有两个风扇混合空气。在气体样品收集期间，使用数字温度计监测箱体和土壤（5 cm）温度。中间部分和底座部分边缘周围有凹槽（4 cm宽×5 cm高）。关闭箱体时，向凹槽中加水使箱体密封。


在箱体覆盖后0、10、20和30分钟，用50 mL一次性注射器从每个箱体采集四个气体样品。所有气体样品用气相色谱仪分析，配备电子捕获检测器（ECD）用于N₂O检测。ECD和色谱柱分别加热至350°C和55°C。N₂O检测的载气为N₂（99.999%纯度）。


估算


N₂O通量使用以下方程计算：


F = ρ × (V/A) × (dc/dt) × [273/(273+T)]


其中F为N₂O通量（μg N₂O-N m⁻² h⁻¹），ρ为N₂O密度，V为箱体体积（m³），A为箱体底面积（m²），dc/dt为箱体中N₂O积累速率（ppm N₂O-N·h⁻¹），T为箱体空气温度。


统计分析


使用SPSS Statistics 20和GraphPad Prism 5软件包进行统计分析。数据采用方差分析（ANOVA），显著性水平为P < 0.05。使用Duncan多重范围检验进行均值比较。采用Pearson相关分析和路径分析检验N₂O排放与土壤氮状况之间的关系。


结果


土壤氮动态


尿素施入土壤后迅速水解。尿素+NBPT处理中的尿素-N含量下降缓慢，在盆栽和田间试验中均显著高于尿素处理（P < 0.05）（图1a,e）。尿素施用后第14天的脲酶抑制率为27.5%，而第35天该值降至1.9%（表1）。在田间试验中，小麦灌浆期施肥后第7天的脲酶抑制率为12.0%（表2）。


表1 盆栽实验施肥后第14天和第35天的脲酶抑制率、表观硝化率、NO3-/NH4+比值及NH4++NO3-+尿素-N占尿素施用量的百分比
盆栽实验 脲酶抑制率 % 表观硝化率 % NO3-/NH4+ (NH4++NO3-+尿素-N)/尿素 %
培养时间（天） 14 35 14 35 14 35 14 35
CK（对照） nd nd 89.3±1.7a 94.2±2.0a 8.6±1.6a 17.8±6.7ab nd nd
尿素 nd nd 86.4±4.0 96.4±1.4a 6.9±2.7a 30.5±13.3a 48.4±5.0 38.0±11.4
尿素+NBPT 27.5 1.9 89.6±1.4a 94.0±1.1a 8.7±1.5a 15.9±2.8b 55.8±8.7 45.4±7.2
数据为3次重复的平均值±标准误。不同字母表示差异显著（P<0.05）。未检测出记为"nd"。


在盆栽和田间试验中，尿素处理和尿素+抑制剂处理的土壤NH₄⁺浓度先升高后降低（图1b,f）。与单独施用尿素相比，尿素+NBPT处理的土壤NH₄⁺浓度在整个培养试验中显著降低了37–64%，在田间试验两个小麦生育期的第3天分别降低了32%和38%。然而，在抽穗期和灌浆期施肥后第7天，尿素加抑制剂处理的土壤NH₄⁺浓度显著高于尿素处理（P < 0.05）（图1b,f）。


在盆栽试验中，NO₃⁻含量在第14天达到峰值，然后保持稳定趋势，尿素处理和尿素+NBPT处理之间没有显著差异（图1c）。相反，在田间试验中，尿素处理的土壤NO₃⁻含量在抽穗期和灌浆期施肥后第5天分别比尿素+NBPT+nitrapyrin处理高32%和20%（图1g）。

图1 培养试验和田间试验土壤中尿素-N（a,e）、NH₄⁺-N（b,f）、NO₃⁻-N（c,g）和（尿素+NH₄⁺+NO₃⁻）-N（d,h）含量的变化


表2 田间实验施肥后第7天的脲酶抑制率、表观硝化率、硝化抑制率、NO3-/NH4+比值及NH4++NO3-+尿素-N占尿素施用量的百分比
生长阶段 处理 脲酶抑制率 % 表观硝化率 % 硝化抑制率 % NO3-/NH4+ (NH4++NO3-+尿素-N)/尿素 %
抽穗期 CK（对照） nd 58.8±7.9b nd 1.4±0.3b nd
尿素 nd 75.5±6.1a nd 3.3±1.5a 28.7±2.9
尿素+NBPT+硝化抑制剂 13.2±0.8 66.0±17.7a 47.7±14.1 1.8±0.6ab 39.2±7.3
灌浆期 CK（对照） nd 61.6±4.0a nd 1.7±1.2a nd
尿素 nd 75.5±1.4a nd 3.0±0.2a 27.5±8.6
尿素+NBPT+硝化抑制剂 12.0±4.2 63.0±17.8a 63.9±18.8 1.7±0.6a 34.2±4.9
数据为3次重复的平均值±标准误。不同字母表示差异显著（P<0.05）。未检测出记为"nd"。


硝化抑制率在小麦抽穗期和灌浆期施肥后第3天分别为47.7%和63.9%（表2）。所有处理在施肥后第14天的NO₃⁻/NH₄⁺比值在6.9–8.7范围内，尿素+NBPT处理的比值比尿素处理低15%（表1）。值得注意的是，在盆栽试验中，施肥后第35天尿素处理的比值是尿素+NBPT处理的2倍（P < 0.05）（表1）。


土壤尿素-N、NH₄⁺和NO₃⁻浓度的变化是动态的（图1d,h）。在盆栽试验中，尿素+NBPT处理的尿素-N、NH₄⁺和NO₃⁻之和在第14天和第35天分别为总氮投入的55.8%和45.4%，显著高于尿素处理（分别为28.7%和39.2%）。在田间处理中也观察到类似趋势。据此，与尿素处理相比，添加NBPT在盆栽试验的第14天和第35天分别减少了7.39%和7.44%的氮损失，在田间试验的抽穗期和灌浆期分别减少了10.53%和6.65%的氮损失。


N₂O排放


在盆栽试验中，加尿素处理在培养第5天达到第一个峰值。对照和单独尿素处理的N₂O浓度在开始时低于NBPT添加处理，并持续8天；然而，到第10天，浓度降至0.35 μmol L⁻¹，与CK平行（图2a）。

图2 14天培养期间土壤中N₂O浓度的24小时实时监测平均值（a）。14天培养第9天N₂O浓度的24小时实时监测（b）。田间试验中的N₂O通量（c）。土壤中N₂O通量的日变化（d）


N₂O浓度在第9至14天之间有规律的昼夜变化。CK和尿素+NBPT处理的N₂O浓度在11:00–13:00达到峰值，然后降至较低水平（图2b）。在田间试验中，N₂O通量呈单峰趋势。最低值123.45 μg m⁻² h⁻¹出现在上午6:00。随着温度升高，N₂O通量增加，在下午18:00达到峰值556.52 μg m⁻² h⁻¹（图2d）。


在田间，三个处理的N₂O通量在小麦生育期施肥后第3、5、7天的上午9:00–11:00测定。N₂O通量在小麦灌浆期和抽穗期呈下降趋势（图2c），而尿素处理的最高N₂O通量在同一时期显著高于其他处理（P < 0.05）。与尿素处理相比，尿素+NBPT+nitrapyrin处理在抽穗期和灌浆期分别降低了30.9%和33.3%的N₂O通量。