材料和方法


菌株。 脱色链球菌菌株S12T（CCTCC M203093T=IAM 15094T）是从纺织印染废水处理厂的活性污泥中分离出来的，并在我们的实验室保存。20,21该菌株可以使用苋菜红（图S1，支持信息）或铁（III） 作为电子受体并在MFC的阳极上形成生物膜。9,20,21来自Luria的单一菌落菌株S12 − 选取Bertani（LB）平板并将其接种到灭菌的LB肉汤中，培养物在30°C下有氧培养过夜。通过离心（6000g）将细胞与培养物分离2分钟，然后使用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次以去除残余营养物。 洗涤后的细胞用作MFC的接种物。


MFC和操作。 如前所述组装双室MFC。使用9块普通石墨板（2 cm×3 cm×0.2 cm）作为阳极和阴极。 使用Ag/AgCl电极（+0.197 V vs标准氢电极）作为阳极的参比电极。 阳极室和阴极室用一块Nafion 115膜（7.1 cm2）隔开。 组装和灭菌（115°C 20 min）后，向阳极室（120 mL）中填充100 mL LM培养基（12.8 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl和10 mM乳酸，pH 6.8）。 为了刺激生物膜生长，向培养基中添加0.05%（w/v）的酵母抽提物。 除非另有说明，否则将不同浓度的偶氮染料苋菜红（0、2、5、7和10 mM）作为替代电子受体添加到阳极室中。 阴极电解质含有100毫升PBS和50毫米铁氰化钾。 在接种（2%，v/v）后，用N2鼓泡阳极室以去除顶空空气和溶解氧，然后用橡胶塞密封。 MFC在30°C下运行，外部电路闭合，包括1000Ω外部电阻器。 一组相同数量的断路MFC与正常厌氧（NA）控制反应器并联运行。 含有不同浓度苋菜红的非生物反应器也用于评估苋菜红的效果和可能的电化学还原。 使用数据记录器（Keithley 2700，模块7702）监测电流生成。 在每种实验条件下，反应器分三次运行。


化学和生理分析。 如前所述，在520 nm处的吸收用于监测苋菜红浓度的变化。如前所述，20,21蛋白质含量被量化，以评估浮游细胞和生物膜的细胞生长，因为偶氮染料因其红色和对细胞分裂的抑制作用，可干扰光学分析和菌落计数。9 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）用于分析生物膜结构和细胞活性 − 24在CLSM分析之前，对阳极上的生物膜进行取样，并将其浸入已灭菌的PBS中，以去除松散附着在生物膜上的浮游细胞或碎屑。 然后用活/死BacLight染色试剂盒（分子探针，Invitrogen）对样品进行染色，并在CLSM（LSM 700，蔡司）下观察。 染色试剂盒是基于细菌膜渗透性开发的，通常用于区分高（绿色）或低（红色）生长活性的细菌，而不是确定细胞是活的还是死的。观察并分析每个阳极生物膜的25个随机取样视野。 为了获得三维（3D）结构信息，在Zen软件（蔡司）的“堆栈”模型下观察生物膜样品。 分析每个生物膜层的比活力，并根据像素计数将其表示为活细胞与总生物膜细胞的比率。9,22生物膜样品的总活力是每个生物膜层的平均活力。


微电极分析。 在苋菜红耗尽之前，使用微电极系统（丹麦Unisense）（图S2，支持信息）测定散装液体和阳极生物膜内的溶解氧、pH值和氧化还原电位分布。26,27在分析之前， 将MFC阳极室的橡胶塞更换为parafilm，通过parafilm插入微电极（尖端直径25μm），并使用SensorTrace Pro（v.3.2.7）软件朝阳极表面下压。 使用显微镜（300×超级眼）监测微电极尖端的位置。


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