材料和程序


研究地点水样采集于新喀里多尼亚泻湖西南部（2000 km2），主要位于努美阿市（125000居民）附近和周围海湾（图1）。西南泻湖的平均深度为21m，主航道的平均深度为25m，而海湾站的深度稍浅（表1）。共有16个站沿3个样带取样，目的是获得较大的营养范围。

图1. 新喀里多尼亚西南泻湖和研究地点的位置。


“开放泻湖”样带（M03、M05、M08、M10、M12；图1）的测站因海水通过南部进入而迅速更新（Douillet 1998）。远离陆地和人为影响，这些站点通常是该地区营养最贫乏的站点。“圣玛丽”样带（N04、N12、N20、N27、N33、M33）位于富营养化的圣玛丽湾。这个海湾接收周围城市地区未经处理的废水。最后，“Grande Rade”站（D01、D05、D08、D16、D22）受到城市污水和镍工业污染物的影响。后两个地点的富营养化程度在海岸和海湾开放之间呈下降趋势。


由于氧气测量设备的可用性，一次只能对一个现场进行取样。对于每次取样，使用海鸟SBE 19 CTD探针记录水柱变量（电导率、温度、体内叶绿素荧光和光合有效辐射）。使用酸洗的5-L Niskin瓶在3m深处采集水样。先前的工作表明，该取样深度提供了整个水柱的代表性样本（Jacquet等人，unpubl.data unref.）。样品保存在尼斯金瓶中，直到90分钟内返回实验室。


细菌呼吸返回实验室后，立即通过125-µm的筛网对600µL的泻湖水进行预筛选，以消除可能增加整个群落耗氧量变化的较大、较不丰富的生物体。然后将过滤后的水分为两组水样：一组用于评估总群落呼吸的未过滤水样和一组过滤到0.6微米孔径的核孔膜上的水样。过滤是在低压差（<100毫米汞柱）下进行的，以避免破坏脆弱的细胞。然后将样品倒入250ml玻璃瓶中，用穿孔硅塞密封，插入微探针，并在±1°C的原位温度下在黑暗中孵化。使用磁力搅拌器使水均匀化。每次实验前，对培养容器、微探针、塞子和搅拌器进行酸洗（盐酸，最终体积的10%）。


用氧微探针连续测定呼吸。Microbes（Unisense，丹麦）采用外部保护阴极（Revsbech 1989）设计，电极本身的耗氧量极低（4.7至47×10–7 mmol O2 h–1）。探针的响应时间小于1s，精度为0.1µM。在14h（圣玛丽和格兰德拉德样品）或24h（开放泻湖样品）期间，每10s由计算机收集一次氧浓度。根据0.6µm过滤水样中的耗氧量估算细菌呼吸。根据5小时内测量的O2与时间的斜率计算细菌呼吸，我们假设该斜率足够短，以尽量减少细菌的产生和数量变化。从观察到氧气显著减少（0.5µM）中选择起始点。假设呼吸商为1，将耗氧量转换为呼吸碳量（µgC L–1 h–1）。


未过滤样品中的叶绿素a-叶绿素a浓度在过滤到GF/F过滤器后测定，该过滤器立即储存在-20°C下，直至分析。叶绿素a浓度后来根据Yentsch和Menzel方法（1963年）进行荧光测定。色素浓度由Lorenzen（1966）计算得出，Jeffrey和Humphrey（1975）对其进行了修改。


细菌丰度细菌丰度从立即用硼砂缓冲福尔马林（2%最终浓度）保存的样品中估算，过滤到0.2µm黑色聚碳酸酯膜上，用DAPI（4′6-二氨基-2-苯基吲哚）染色，并在-20°C下储存，直到荧光显微镜下计数。在至少20个字段中重复计数400多个细菌，以获得10%的变异系数（Kirchman等人，1982年）。在每次呼吸培养开始和结束时测定细菌丰度。


3H-胸腺嘧啶核苷的掺入细菌DNA合成，通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入冷三氯乙酸（TCA）可沉淀材料中来测定细菌产量。在原位温度（±1°C）下，用3H-[甲基]胸苷（最终浓度15 nM，1.8 TBq mmol–1，Amersham）在黑暗中培养5至10 mL水样的两份或三份，培养1 h。以前的实验表明，在这个浓度下，总是能达到饱和。通过添加缓冲福尔马林（最终浓度为2%）停止活性。通过0.2-µm聚碳酸酯膜在低压（<100 mm Hg）下过滤收集标记材料，并允许其在4°C下用冰冷TCA（5%w/v）沉淀15分钟。用5毫升5%冷TCA冲洗膜3次。然后用0.5 N HCl在100°C下加热30分钟水解DNA。加入4 mL闪烁鸡尾酒后，在淬火校正后，用Packard TriCarb闪烁计数器测量放射性。在每次呼吸培养开始和结束时测定细菌DNA合成。3H-胸腺嘧啶核苷掺入率使用2.91×1018细胞mol–1胸腺嘧啶核苷的转换因子转换为细胞产量（Jacquet unpubl.数据unref.）。


BGE测定一般情况下，BGE是根据从短培养时间（即~1小时）测定的胸腺嘧啶核苷或亮氨酸掺入估计的细菌产量，以及从培养24小时后测得的细菌呼吸（使用温克勒O2滴定法）计算得出的。在本研究中，BGE的计算公式如下：

BBPnet为净细菌生物量生产量，即所考虑的培养时间开始和结束之间的细菌生物量差异，BR为细菌呼吸，以碳单位转换。细菌丰度（106个细胞mL-1）到碳生物量（µg C L-1）的转换是使用20个fgC细胞-1的转换因子完成的（Lee和Fuhrman 1987），尽管该因子仍存在相当大的不确定性（Fukuda et al.1998）。


使用氧微电极来研究细菌的呼吸作用以确定浮游细菌的生长速率——摘要

使用氧微电极来研究细菌的呼吸作用以确定浮游细菌的生长速率——材料和程序

使用氧微电极来研究细菌的呼吸作用以确定浮游细菌的生长速率——看法

使用氧微电极来研究细菌的呼吸作用以确定浮游细菌的生长速率——讨论、意见和建议！