微电穿孔和细胞内动作电位记录的模拟


微电极阵列通过向微电极表面施加电压来记录心肌细胞的细胞内动作电位。微电极表面局部电场的过程在细胞膜上产生瞬时纳米孔，细胞膜阻抗降低，因此微电极记录到动作电位。为了深入了解微电穿孔前后电信号波形的变化，使用Multisim软件模拟了细胞-电极界面的无源电路模型。该模型的等效电路基于电阻-电容并联元件，由三个主要部分组成：心肌细胞、细胞与金微电极之间的间隙以及金微电极本身（图2a, b）。

图2. 用于细胞内动作电位记录的微电穿孔模拟。

a, b 细胞-电极接口的等效电路图，以及其在微电穿孔前后对应状态下的元件值。

c 动作电位模拟。 (i) 原始动作电位波形。(ii) 模拟的微电穿孔前细胞外场电位波形。(iii) 模拟的微电穿孔后细胞内动作电位波形。

d, e 模拟两个细胞耦合到一个电极的情况。(d) 两个细胞在一个微电极上的耦合示意图。(e) 模拟的两个细胞耦合到一个微电极时的双峰动作电位波形。

f 心肌细胞在微电极上随机分布的光学显微镜图像。

g 细胞与不同尺寸微电极耦合的模拟模型示意图。(i) 小尺寸，(ii) 中尺寸，(iii) 大尺寸微电极。

h 用于模拟的细胞-微电极三维模型。

i-k 在3V电压下，细胞耦合到不同尺寸微电极时的电势分布模拟结果：(i) 20微米，(j) 100微米，(k) 400微米微电极。

l-n 用于提取电势的垂直参考线位置：(l) 20微米，(m) 100微米，(n) 400微米微电极。

o-q 沿图l-n所示参考线的电势分布，以及计算得到的跨膜电压。

r-t 在3V电压下，细胞耦合到不同尺寸微电极时的电流密度分布（上部）和电场模量分布（下部）模拟结果：(r) 20微米，(s) 100微米，(t) 400微米微电极。


具体来说，该模型从上到下包括：细胞上表面细胞膜与细胞外溶液之间的非连接膜（非连接电容和电阻记为Cnj, Rnj）。细胞下表面细胞膜与金微电极之间的连接膜（连接电容和电阻记为Cj, Rj）。这一部分代表了心肌细胞通过磷脂膜上的粘附分子与金微电极上的纤连蛋白相互作用而紧密耦合。细胞与金微电极之间的间隙充满了离子溶液，由封接电阻Rseal表示。最后，还有一个用于信号传输和记录的前置放大器。动作电位的产生与心肌细胞连接膜和非连接膜中离子通道的切换和移动有关。在模拟中，将标准方法获得的动作电位用作原始动作电位（图2c(i)）。在微电穿孔之前，细胞膜的Cj和Rj较高。模拟的细胞外场电位在波形特征上与同步记录的细胞外场电位相似，显示出经典的双相脉冲模式（图2c(ii)）。


在微电穿孔期间，细胞膜中形成微小的瞬时纳米孔，导致Cj和Rj均降低。此时，模拟的细胞内动作电位与同步记录的细胞内动作电位波形相似；两者都显示出典型的去极化、复极化和静息期特征（图2c(iii)）。因此，基于微电穿孔技术使用较大尺寸微电极进行细胞内动作电位记录在理论上得到了验证。在记录细胞内动作电位时，每个微电极记录到的信号应对应于单个细胞。为了探索当多个细胞耦合到同一微电极时对记录波形的影响，设计了一个电路模型（图2d）。如图2e所示，当两个心肌细胞耦合到同一微电极时，记录到的信号显示出双峰现象。这是因为两个心肌细胞之间的动作电位传播存在时间滞后。


为了优化电穿孔电压并理解微电极尺寸对电穿孔过程中电行为的影响，使用COMSOL Multiphysics软件进行了三维模拟。光学显微镜图像显示，心肌细胞随机分布在微电极表面（图2f）。在模拟中，设置了细胞与不同尺寸微电极的耦合，包括细胞耦合到小尺寸微电极表面、细胞耦合到中等尺寸微电极表面以及细胞耦合到大尺寸微电极表面的情况（图2g）。如图2h所示，模拟的心肌细胞直径设为80微米，细胞膜设为10纳米厚的边界层，并在细胞-介质界面设置了100纳米的间隙。微电极由位于2毫米厚SiO2基底上的100纳米金层组成，参比电极位于金微电极正上方，浸没在培养基中。


为了筛选合适的电穿孔电压，在模型中对微电极表面施加1-5V的电压。然后观察细胞及其周围环境的电势分布，并统计细胞膜两侧的跨膜电压大小。如图2j所示，随着施加电压的增加，细胞膜两侧的电势差值逐渐增加。如图2m所示，为了定量分析跨膜电压，在模拟模型中设置了垂直参考线（1-5）和参考点（a-j）。


通过统计参考线的电势来计算参考点处的跨膜电压（图2p）。通过增加微电穿孔电压的幅度（1至5V），当微电穿孔电压为3V时，细胞膜两侧的跨膜电压大于1.2V，这可以穿孔细胞膜。获得模拟优化的电压后，我们使用自建的电生理信号数据采集系统进行细胞内动作电位记录测试，该系统可控制脉冲生成。我们获得了在1-5V脉冲电压电穿孔后心肌细胞的细胞内动作电位。当微电穿孔电压为3V时，该电压可以高效地（84.28%）穿孔细胞膜，而不会显著影响心肌细胞的搏动频率。


在探索电极尺寸对电穿孔电行为的影响时，我们在模型中向电极施加了3V的电压。模型显示，随着电极尺寸的增加，细胞膜两侧的电势变化变得不那么明显（图2i-k）。我们提取了沿参考线（图2l-n）的电势并计算了跨膜电压（图2o-q）。结果表明，随着电极尺寸的增加，跨膜电压从1.69V降低到1.21V。电流密度分布显示，电极尺寸越大，电流越容易从无细胞覆盖的区域泄漏（图2r-t，上部）。电场模量分布显示，电极尺寸越大，细胞膜区域的场强越小（图2r-t，下部）。


随着电极尺寸的增加，参考点处的平均电场模量从16.12 V/微米降低到11.35 V/微米。我们还探讨了细胞生长点处穿孔的可能性。模拟结果表明，当心肌细胞与微电极表面的耦合面积减小时，细胞膜底部两侧的电势差表现出跨膜电位差减小的趋势。我们同样提取了沿参考线的电势，并统计了参考点处的跨膜电压。结果表明，当心肌细胞完全耦合到微电极时跨膜电压最高，这使得实现微电穿孔最容易。