三、特性表征与肌电图测量


3.1电化学特性表征


为了评估增加的3D结构和多孔PEDOT:PSS涂层的优势，我们在生理盐水溶液（0.9%NaCl）中使用Ag/AgCl参比电极，在2电极设置中获得了平面和3D电极在1kHz下的阻抗，这些电极均具有金和PEDOT:PSS表面处理层。我们比较了如图3所示的不同尺寸从200μm×200μm到5μm×5μm的电极位点（n=8）的平均阻抗。具有3D微锥的电极在所有足迹尺寸下，无论是金还是PEDOT:PSS表面处理，都显示出显著的阻抗降低。与金电极相比，PEDOT:PSS涂层进一步降低了3D微锥电极的阻抗，这与之前的观察结果一致。对于10μm×10μm的电极位点，PEDOT:PSS涂层的3D微锥电极与平面金电极相比，阻抗降低了99.3%。制造的具有PEDOT:PSS涂层的最小3D微锥电极，尺寸为5μm×5μm，平均阻抗为146.5 kOhm；这相当于80μm×80μm 2D金电极的阻抗。

图3.1kHz下八个不同足迹面积的的平均阻抗，以展示3D结构和多孔PEDOT:PSS涂层的改进（n=8）。


我们进一步通过比较平面金电极与具有代表性足迹尺寸的3D PEDOT:PSS涂覆微锥电极之间的电化学阻抗谱（EIS）结果，验证了阻抗的降低，如图4所示。实验在盐溶液中进行，使用Ag/AgCl参比电极和铂网对电极的3电极系统。阻抗幅值的变化与我们1 kHz下的结果一致，因为3D微锥加上PEDOT涂层在测试的频率范围从0.1 Hz到100 kHz内，对于所有尺寸都显著降低了阻抗值。

图4.对四种不同足迹尺寸的3D PEDOT:PSS涂覆微电极和2D金微电极进行电化学阻抗谱（EIS）测量。


循环伏安法测量也使用同样的三电极装置进行，以确定制造的3D微锥电极的充电存储容量（CSC）。图5展示了足迹为200μm×200μm的3D微锥电极的CV结果，计算得到的CSC为34.2 mC/cm^(-2)。这证明了其用于刺激应用的可行性，所测得的CSC与已发表的一些刺激电极相比具有可比性或更优。

图5.在生理盐水中，对边长为200微米的PEDOT:PSS涂覆3D电极进行循环伏安法测量，扫描速率为100 mV/s。


3.2肌电图测量与数据分析


使用带有微锥的制造的3D MEAs来记录麻醉小鼠的二腹肌的肌电活动。所有程序均得到埃默里大学机构动物关怀和使用委员会的批准。在成年C57BL/6J雄性小鼠（2只）被麻醉到适当深度（4%（体积比）异氟醚氧气气体）后，在下颌下做一切口，并去除皮肤以暴露二腹肌。将电极阵列放置在肌肉表面，通过Omnetics连接器收集自发发生的运动单位活动，该连接器与一个包含数字放大器的32通道RHD记录头stage（RHD2132；Intan Technologies）接口。肌电信号通过RHD USB接口板（部件C3100；Intan Technologies）在计算机上以30 Hz的频率记录，使用标准方法识别不同运动单位的光谱，这些方法使用主成分分析（PCA）和k-means对形状相似的波形进行聚类。每个尖峰簇的幅度是通过测量该簇中每个波形的平均峰值来测量的。每个通道的噪声水平是通过信号不包含任何尖峰的一分钟段的均方根（RMS）来测量的。然后通过将每个尖峰簇的幅度除以相应通道的噪声水平来计算每个尖峰的信噪比（SNR）。


[SNR=left|frac{V_{peak}}{noiseRMS}right|](1)


使用低阻抗的3D MEAs，成功从小鼠身上获得了高质量的肌电图记录，其中检测到了单个和多个运动单位（图6）。在单个运动单位记录中，设备能够检测到动作电位时间和幅度的微小差异，这表明电极具有高时间和空间分辨率，可以区分电极接触点相对于活动肌肉纤维的不同位置。这些通道间的变化允许从单个记录中隔离多个运动单位。多个运动单位的记录进一步显示，与其它论文相比，我们的设备具有显著更高的信噪比。对于尖峰较小的运动单位，我们实现了平均信噪值203.3，而对于尖峰较大的运动单位，平均信噪值为447.3（图6(b)顶部）。

图6.高分辨率肌电图记录与微锥MEA。(a)从小鼠二腹肌记录的单个运动单位示例。在这里，大约有电极阵列32个通道的一半检测到了单个动作电位。(b)从单个MEA通道记录的多个运动单位。顶部，在二腹肌上记录的一个时期，两个不同的运动单位同时被记录，它们可以通过不同的幅度在视觉上区分。底部，三个单个尖峰及其相应信噪比值的细节。


四、结论


在这篇论文中，我们介绍了一种具有3D微锥和PEDOT:PSS涂层的柔性且生物相容的微电极阵列，该阵列在活体实验中提供了高信噪比。通过提出的创新制造工艺，我们使用光定义型聚酰亚胺构建了微锥，使得有效表面积增加了高达250%。对各种尺寸的电极进行了电化学表征，其中我们设备的阻抗在测试频率范围内始终优于基准设备。特别是，在1kHz时的阻抗降低了两个数量级。循环伏安法的结果显示，200μm×200μm电极的CSC值为34.2 mC/cm^(2)，这表明其具有刺激应用的潜力。三维微锥电极成功植入小鼠二腹肌以获取急性数据，通过多个运动单位记录测得信噪比为447.3。凭借实现的高信噪比，我们的设备为成功获取和分析单个运动单位活动提供了一种有前景的方法。