2植物细胞pH值荧光显微成像


与Ca2+相似，质子作为带电离子必须严格控制在合适的浓度。H+参与信号转导、而且直接影响植物发育。鉴于此，测量细胞pH是植物学家们的一个重要目标。传统上讲，人们一般用选择性质子微电极等方法来对细胞pH进行测量。这些技术虽得到应用，但有很多不足，如分辨率低、时间响应滞后等。传统的测细胞pH值的微电极方法，在实践上仍有很多不足。由于pH在细胞内也是动态变化的，因此用荧光指示剂捕获这一动态变化过程，是测定pH极佳的方法。


2.1质外体pH


质外体是植物细胞膜外区域，包括细胞壁、细胞间隙和木质部。这一区域的离子环境会影响物质的跨膜运输，尤其直接影响根部的营养吸收和溶质传输。细胞壁的pH也调整其延展性与稳定性、进而调节细胞形状的大小。植物激素在质外体的运输，也会受到质子化水平的影响。撇开细胞壁pH对植物众多生理功能的影响不谈，测定其数值仍然是确定质外体pH对生长发育调控的关键。有许多方法都是利用共聚焦显微镜来观察荧光探针对质外体pH的标记。指示剂一般是用荧光粉或其衍生物来充当。荧光粉染料通常被用来作为双重激发态比例指示剂，即一方面其一个激发态峰值的形成完全不依赖于细胞pH值、另一方面其第二个激发态峰值的形成完全依赖pH值。细胞pH值可根据二者激发态强度变化，按比例计算出来。目前细胞pH值的测定大体都按这种方式进行，代表着该技术的新方向。


2.2细胞质pH监测


由于细胞溶质是强缓冲液、加之H+-ATP质子泵和多聚焦磷酸化的作用，植物细胞pH一般情况下维持在7.2左右。H+-ATP质子泵一般定位在细胞质膜和内膜上，其工作结果是去除胞质过多H+。最近有研究发现，细胞质pH值也受到了精巧的调节、以期响应外界刺激或植株生长。


当前，灵敏的荧光pH探针与高分辨率的空间图像相偶联，不仅使得人们可以使用荧光显微镜观察亚细胞水平pH值的不均一性、而且可以观察到不同细胞pH值的动态变化。基于荧光显微镜使用的灵敏细胞质pH荧光染料一直是观察和测定胞质pH的首选方法。目前，胞质pH荧光蛋白瞬时表达技术受到研究和使用者的欢迎，该技术还在发展之中。


3植物细胞ROS活体原位成像


3.1单线态氧细胞成像探针


3.2超氧阴离子细胞成像

图2 4 d拟南芥根尖50-μM H2DCF-DA染色结果


(a)H2DCF-DA染色和加载的时间进程；(b)单个根尖细胞光漂白、染料吸收和泄漏，以及氧化还原势的不同复合状态；(c)根尖加载H2DCF-DA 10 min后,激光共聚焦显微成像，然后再根据要求扫描目标区域活性氧；(d)总作用时间为26 s，扫描结束后，表皮外周细胞染色因光漂白逐渐变暗，而毗邻的细胞因成像胁迫诱导产生ROS变亮。


3.3过氧化氢显像探针


二氨基联苯(3,3-Diaminobenzidine，DAB)是水溶性有机化合物，能与过氧化氢(H2O2)起反应，生成深褐色多聚物。与NBT使用方式相仿，DAB被用来进行植物生物胁迫或伤害胁迫条件下H2O2原位显色。值得注意的是DAB对植物细胞有毒性，并且易于被光降解。荧光素衍生物2,7-二氯荧光黄(dihydrodichlorofluorescein diacetate，H2DCF-DA)目前被广泛作为过氧化氢实时显像荧光探针。由于与H2O2的高反应活性且可以直接通过细胞膜进入细胞，H2O2已被普遍用来监测植物细胞H2O2的积累(图2)。与其他ROS染料或传感器相比，H2DCF-DA具有可视化程度高、加载进入细胞方便等优点，但是该染料探针在完整细胞内不稳定、易于发生光氧化或光猝灭作用。在应用中宜快、不宜慢。


4总结和展望


荧光探针为确定植物细胞Ca2+、pH和ROS的时空动态变化提供了一个强有力的工具和办法。随着人们对荧光探针与目标信号分子相互作用模式认识的深入，这些探针在对信号分子定量分析方面将起十分重要的作用。尽管本文讨论仅限于Ca2+、pH和ROS探针，但是更广泛的染料和修饰化GFP荧光蛋白感受器、已经被用来监测G-蛋白活性、蔗糖浓度和酶活性等。荧光蛋白感受器的出现，使得显微成像更为容易、尤其是用于转化细胞、可以免除染料添加等定位试验。期待着能有一个荧光蛋白数据库资源，届时亚细胞信号定位方面的试验开展将更为便捷，也可以丰富人们对亚细胞信号动态变化的理解。目前，由于可以获取多个荧光探针，因而可以同时测定多个细胞位点多个参数。这种多渠道获取的荧光图像，无疑对于我们确定亚细胞水平上标志性信号元件、有至关重要的作用。